Молекулярно-биологические методы исследования и их использование

Молекулярно-биологические методы исследования играют большую роль в современной медицине, криминалистике и биологии. Благодаря достижениям в области изучения ДНК и РНК, человек способен изучить геном организма, определить возбудителя заболевания, распознать нужную нуклеиновую кислоту в смеси кислот и т.д.

Молекулярно-биологические методы исследования. Что это такое?

Еще в 70-80-х годах ученым впервые удалось расшифровать геном человека. Это событие дало толчок развитию генной инженерии и молекулярной биологии. Изучение свойств ДНК и РНК привело к тому, что теперь можно использовать эти нуклеиновые кислоты в целях диагностики заболевания, изучения генов.

методы молекулярной диагностики

Получение ДНК и РНК

Молекулярно-биологические методы диагностики требуют наличия исходного материала: чаще это нуклеиновые кислоты. Существует несколько способов выделения этих веществ из клеток живых организмов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки, и это надо учитывать при выборе метода выделения нуклеиновых кислот в чистом виде.

1. Получение ДНК по Мармуру. Метод заключается в обработке смеси веществ спиртом, в результате чего чистая ДНК выпадает в осадок. Минусом этого способа является использование агрессивных веществ: фенола и хлороформа.

2. Выделение ДНК по Буму. Основное вещество, которое используется здесь, – это гуанидин тиоционат (GuSCN). Оно способствует осаждению дезоксирибонуклеиновой кислоты на специализированных субстратах, с которых в последующем можно ее собрать с помощью специального буфера. Однако GuSCN – это ингибитор ПТЦ, и даже небольшая его часть, попавшая в осажденную ДНК, может повлиять на ход полимеразной цепной реакции, которая играет важную роль при работе с нуклеиновыми кислотами.

3. Осаждение примесей. Метод отличается от предыдущих тем, что осаждаются не сами молекулы дехоксирибонуклеиновой кислоты, а примеси. Чтобы это осуществить, используют ионообменники. Недостаток в том, что не все вещества могут осадиться.

4. Массовый скрининг. Используется этот способ в тех случаях, когда не нужны точные сведения о составе молекулы ДНК, а необходимо получить какие-то статистические данные. Объясняется это тем, что структура нуклеиновой кислоты может повредиться при обработке детергентами, в частности, щелочами.

молекулярная диагностика

Классификация методов исследования

Все молекулярно-биологические методы исследования делятся на три большие группы:

1. Амплификационные (с использованием множества ферментов). Сюда относится ПЦР – полимеразная цепная реакция, которая играет большую роль во многих из методов диагностики.

2. Неамплификационные. Эта группа методов связана непосредственно с работой смесей нуклеиновых кислот. Примерами являются 3 вида блоттингов, in situ гибридизация и т.д.

3. Методы, основанные на распознавании сигнала от молекулы зонда, который связывается с определенной ДНК или РНК зонда. Пример - система гибридизации в растворе Hybride Capture System (hc2).

Ферменты, которые могут использоваться в молекулярно-биологических методах исследования

Многие методы молекулярной диагностики подразумевают использование обширного диапазона ферментов. Ниже представлены применяемые наиболее часто:

1. Рестриктаза – «режет» молекулу ДНК на необходимые части.

2. ДНК-полимераза – синтезирует двухцепочечную молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты.

3. Обратная транскриптаза (ревертаза) – используется для синтеза ДНК на матрице РНК.

4. ДНК-лигаза – отвечает за образование фосфодиэфирных связей между нуклеотидами.

5. Экзонуклеаза – удаляет нуклеотиды с концевых участков молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты.

молекулярно-биологические методы диагностики

ПЦР – основной способ амплификации ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) активно используется в современной молекулярной биологии. Это метод, при котором из одной молекулы ДНК можно получить огромное количество копий (амплифицировать молекулы).

Основные функции ПЦР:

- диагностика заболеваний;

- клонирование участков ДНК, генов.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимы следующие элементы: исходная молекула ДНК, термостабильная ДНК-полимераза (Taq или Pfu), дезоксирибонуклеотид-фосфаты (источники азотистых оснований), праймеры (2 праймера на 1 молекулу ДНК) и сама буферная система, в которой возможно проведение всех реакций.

ПЦР состоит из трех этапов: денатурация, отжиг праймеров и элонгация.

1. Денатурация. При температуре 94-95 градусов по Цельсию просходит разрыв водородных связей между двумя цепями ДНК, и в итоге мы получаем две одноцепочечные молекулы.

2. Отжиг праймеров. При температуре 50-60 градусов по Цельсию происходит присоединение праймеров на концах одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты по типу комплиментарности.

3. Элонгация. При температуре 72 градусов происходит синтез дочерних двухцепочечных молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты.

молекулярно-биологические методы исследования

Секвенирование ДНК

Молекулярно-биологические методы исследования часто требуют знания последовательности нуклеотидов в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты. Для определения генетического кода проводится секвенирование. Молекулярная диагностика будущего будет основана на знаниях, полученных при определении последовательности человека.

Выделяют следующие виды секвенирования:

  • секвенирование по Максаму-Гилберту;
  • секвенирование по Сэнгеру;
  • пиросеквенирование;
  • нанопоровое секвенирование.

Статья закончилась. Вопросы остались?
Комментариев 1
Подписаться
Я хочу получать
Правила публикации
0
Сферы применения молекулярно-микробиологических методов исследования?
Копировать ссылку
Редактирование комментария возможно в течении пяти минут после его создания, либо до момента появления ответа на данный комментарий.