Существует много различных методов анализа состава и изучения свойств различных соединений и смесей веществ. Одним из таких методов является хроматография. Авторство в изобретении и применении метода принадлежит русскому ботанику М. С. Цвету, который в начале XX века осуществил разделение растительных пигментов.
Определение и основы метода
Хроматография – это физико-химический метод разделения смесей и определения их компонентов, основанный на распределении между подвижной и неподвижной фазами веществ, входящих в состав смеси (пробы). Неподвижная фаза представляет собой пористое твердое вещество – сорбент. Также это может быть жидкостная пленка, нанесенная на твердую поверхность. Подвижная фаза – элюент – должна перемещаться вдоль неподвижной фазы либо протекать через нее, фильтруясь при этом сорбентом.
Сущность хроматографии состоит в том, что разные компоненты смеси обязательно характеризуются различными свойствами, такими как молекулярная масса, растворимость, адсорбируемость и так далее. Поэтому скорость взаимодействия компонентов подвижной фазы – сорбатов – с неподвижной неодинакова. Это приводит к различию в скоростях движения молекул смеси относительно неподвижной фазы, вследствие чего компоненты разделяются и концентрируются в различных зонах сорбента. Некоторые из них покидают сорбент вместе с подвижной фазой – это так называемые неудерживаемые компоненты.
Особым достоинством хроматографии является то, что она позволяет достаточно быстро разделять сложные смеси веществ, в том числе и близких по свойствам.
Способы классификации видов хроматографии
Методы, используемые в анализе, можно классифицировать по различным критериям. Основной набор таких критериев следующий:
- агрегатное состояние неподвижной и подвижной фаз;
- физико-химическая природа взаимодействия сорбента и сорбатов;
- способ введения элюента и его перемещения;
- способ размещения неподвижной фазы, то есть техника проведения хроматографии;
- цели хроматографирования.
Кроме того, методы могут основываться на разной природе сорбционного процесса, на технических условиях проведения хроматографического разделения (например, низкое или высокое давление).
Рассмотрим подробнее вышеперечисленные основные критерии и связанные с ними наиболее широко используемые виды хроматографии.
Агрегатное состояние элюента и сорбента
По этому признаку хроматография подразделяется на жидкостную и газовую. Названия методов отражают состояние подвижной фазы.
Жидкостная хроматография – это метод, применяемый в процессах разделения смесей высокомолекулярных соединений, в том числе биологически важных. В зависимости от агрегатного состояния сорбента она делится на жидкостно-жидкостную и жидкостно-твердофазную.
Газовая хроматография бывает следующих видов:
- Газоадсорбционная (газо-твердофазная), в которой используется твердый сорбент, например уголь, силикагель, цеолиты либо пористые полимеры. В роли элюента – переносчика разделяемой смеси выступает инертный газ (аргон, гелий), азот, углекислый газ. Разделение летучих компонентов смеси осуществляется благодаря разной степени их адсорбции.
- Газо-жидкостная. Неподвижная фаза в данном случае состоит из пленки жидкости, нанесенной на твердую инертную основу. Компоненты пробы разделяются сообразно их адсорбируемости или растворимости.
Метод газовой хроматографии широко применяется для анализа смесей органических соединений (с использованием продуктов их распада или производных в газообразной форме).
Взаимодействие сорбента и сорбатов
По данному критерию выделяют такие виды, как:
- Адсорбционная хроматография, посредством которой осуществляется разделение смесей за счет различий в степени адсорбции веществ неподвижным сорбентом.
- Распределительная. С ее помощью проводят разделение на основе разной растворимости компонентов смеси. Растворение происходит либо в подвижной и неподвижной фазах (в жидкостной хроматографии), либо только в неподвижной фазе (в газо-жидкостной хроматографии).
- Осадочная. В основе этого метода хроматографии лежит разная растворимость образующихся осадков разделяемых веществ.
- Эксклюзионная, или гель-хроматография. Базируется на различии в размерах молекул, благодаря чему варьирует их способность проникать в поры сорбента – так называемой гелевой матрицы.
- Аффинная. Этот специфический метод, основой которого служит особый тип биохимического взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, образующим комплексное соединение с инертным носителем в неподвижной фазе. Данный метод эффективен при разделении смесей белков-ферментов и распространен в биохимии.
- Ионообменная. В качестве фактора разделения пробы этот способ использует различие в способности компонентов смеси к ионному обмену с неподвижной фазой (ионообменником). В ходе процесса происходит замещение ионов неподвижной фазы ионами веществ в составе элюента, при этом вследствие разного сродства последних к ионообменнику возникает разница в скорости их перемещения, и таким образом смесь разделяется. Для неподвижной фазы чаще всего употребляются ионообменные смолы – особые синтетические полимеры.
Ионообменная хроматография имеет два варианта – анионный (задерживает отрицательные ионы) и катионный (задерживает соответственно положительные ионы). Применяется данный метод чрезвычайно широко: в разделении электролитов, редкоземельных и трансурановых элементов, в очистке воды, в анализе лекарственных препаратов.
Различие методов по технике проведения
Существуют два основных способа, посредством которых проба перемещается относительно неподвижной фазы:
- Колоночная хроматография осуществляет процесс разделения в особом устройстве – хроматографической колонке – трубке, во внутренней полости которой помещается неподвижный сорбент. По способу заполнения колонки подразделяются на два типа: насадочные (так называемые «набивные») и капиллярные, в которых слой твердого сорбента или жидкостная пленка неподвижной фазы наносится на поверхность внутренней стенки. Насадочные колонки могут иметь различную форму: прямую, U-образную, спиральную. Капиллярные колонки имеют спиральную форму.
- Плоскостная (планарная) хроматография. В качестве носителя для неподвижной фазы в данном случае может применяться специальная бумага либо пластина – металлическая, стеклянная, пластиковая – на которую нанесен тонкий слой сорбента. Метод хроматографии при этом именуется соответственно бумажным или тонкослойным.
В отличие от колоночного метода, где хроматографические колонки используются многократно, в плоскостной хроматографии любой носитель со слоем сорбента может быть использован только один раз. Процесс разделения происходит при погружении пластины или листа бумаги в емкость с элюентом.
Ввод и перемещение элюента
От этого фактора зависит характер перемещения по слою сорбента хроматографических зон, образующихся при разделении смеси. Различают следующие методы подачи элюента:
- Фронтальный. Этот способ наиболее прост по технике выполнения. Подвижной фазой служит непосредственно сама проба, непрерывно подаваемая в колонку, заполненную сорбентом. При этом наименее удерживаемый компонент, адсорбируемый хуже прочих, перемещается вдоль сорбента быстрее остальных. В итоге только этот первый компонент может быть выделен в чистом виде, далее следуют зоны, содержащие смеси компонентов. Распределение пробы выглядит таким образом: A; A+B; A+B+C и так далее. Фронтальная хроматография не применяется поэтому для разделения смесей, но она эффективна в различных процессах очистки, при условии, что выделяемое вещество имеет низкую удерживаемость.
- Вытеснительный метод отличается тем, что после ввода разделяемой смеси в колонку подается элюент со специальным вытеснителем – веществом, характеризующимся большей сорбируемостью, чем любой из компонентов смеси. Оно вытесняет наиболее удерживаемый компонент, тот вытесняет следующий и так далее. Проба движется по колонке со скоростью вытеснителя и образует примыкающие друг к другу зоны концентрации. С помощью этого вида хроматографии можно получить на выходе из колонки каждый компонент индивидуально в жидком виде.
- Элюентный (проявительный) метод является наиболее распространенным. В отличие от вытеснительного метода, элюент (носитель) в данном случае имеет меньшую сорбируемость, чем компоненты пробы. Он непрерывно пропускается через слой сорбента, промывая его. Периодически порциями (импульсами) в поток элюента вводится разделяемая смесь, после чего снова подается чистый элюент. При вымывании (элюировании) происходит разделение компонентов, причем зоны концентрации их разделены зонами элюента.
Элюентная хроматография дает возможность практически полного разделения анализируемой смеси веществ, причем смесь может быть многокомпонентной. Также достоинствами этого метода являются изоляция компонентов друг от друга и простота количественного анализа смеси. К недостаткам можно отнести большой расход элюента и низкую концентрацию в нем компонентов пробы после разделения на выходе из колонки. Элюентный метод широко применяется как в газовой, так и в жидкостной хроматографии.
Хроматографические процессы в зависимости от целей
Различие по целям хроматографирования позволяет выделить такие методы, как аналитический, препаративный и промышленный.
Посредством аналитической хроматографии проводится качественный и количественный анализ смесей. При анализе компоненты пробы при выходе из колонки хроматографа поступают на детектор – устройство, чувствительное к изменению концентрации вещества в элюенте. Время, прошедшее от момента подачи пробы в колонку до максимума пика концентрации вещества на детекторе, называется временем удерживания. При условии постоянства температуры колонки и скорости элюента эта величина постоянна для каждого вещества и служит основой для качественного анализа смеси. Количественный анализ проводится путем измерения площади отдельных пиков на хроматограмме. Как правило, в аналитической хроматографии используется элюентный метод.
Препаративная хроматография имеет целью выделение чистых веществ из смеси. Препаративные колонки имеют гораздо больший диаметр, чем аналитические.
Промышленная хроматография применяется, во-первых, для получения больших количеств чистых веществ, необходимых в том или ином производстве. Во-вторых, это важная часть современных систем контроля и регулирования технологических процессов.
Промышленный хроматограф имеет шкалу концентрации того или иного компонента и снабжен датчиком, а также системами управления и регистрации. Поступление проб на такие хроматографы производится автоматически с определенной периодичностью.
Многофункциональное оборудование для хроматографии
Современные хроматографы представляют собой сложные высокотехнологичные устройства, способные к применению в самых различных областях и с различными целями. Эти приборы позволяют анализировать сложные многокомпонентные смеси. Они оснащены широким набором детекторов: термокондуктометрическими, оптическими, ионизационными, масс-спектрометрическими и так далее.
Кроме того, в современной хроматографии используются автоматические системы управления процессом анализа и обработки хроматограмм. Управление может производиться с компьютера либо непосредственно с прибора.
Примером такого устройства является многофункциональный газовый хроматограф "Кристалл 5000". Он имеет набор из четырех детекторов с возможностью замены, колоночный термостат, системы электронного регулирования давления и расхода рабочих веществ, а также управления газовыми кранами. Для решения разнообразных задач устройство имеет возможность установки как насадочных, так и капиллярных колонок.
Хроматограф управляется при помощи полнофункциональной клавиатуры и контрольного дисплея либо (в другой модификации) с персонального компьютера. Это устройство нового поколения может эффективно применяться на производстве и в различных научно-исследовательских лабораториях: медицинских, криминалистических, экологических.
Хроматография высокого давления
Проведение жидкостной колоночной хроматографии характеризуется довольно большой длительностью процесса. Для ускорения движения жидкого элюента применяют подачу подвижной фазы в колонку под давлением. Этот современный и весьма перспективный способ получил название метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Насосная система, входящая в состав жидкостного хроматографа для ВЭЖХ, обеспечивает подачу элюента с постоянной скоростью. Развиваемое давление на входе может достигать 40 Мпа. Компьютерное управление дает возможность менять состав подвижной фазы по заданной программе (такой метод элюирования называется градиентным).
ВЭЖХ могут применяться различные методы, основанные на характере взаимодействия сорбента и сорбата: распределительная, адсорбционная, эксклюзионная, ионообменная хроматография. Наиболее распространенной разновидностью ВЭЖХ является обращенно-фазовый метод, основанный на гидрофобном взаимодействии полярной (водной) подвижной фазы и неполярного сорбента, например силикагеля.
Метод широко применяется для разделения, анализа, контроля качества нелетучих, термически неустойчивых веществ, которые не могут быть переведены в газовое состояние. Это агрохимикаты, лекарственные препараты, компоненты пищевых продуктов и прочие сложные вещества.
Значение хроматографических исследований
Различные виды хроматографии широко используются в самых разных областях:
- неорганическая химия;
- нефтехимия и горное дело;
- биохимия;
- медицина и фармацевтика;
- пищевая промышленность;
- экология;
- криминалистика.
Список этот неполон, но отражает охват отраслей, которые не могут обойтись без хроматографических методов анализа, разделения и очистки веществ. Во всех областях применения хроматографии, от научных лабораторий до промышленного производства, роль этих методов еще более возрастает по мере внедрения современных технологий обработки информации, управления и контроля над сложными процессами.
