21-й век - это век, совершающий семимильные шаги в области технологического прогресса, стремительно развиваются наука и медицина. Современный уровень прогресса позволяет претворить в жизнь то, что раньше казалось человеку невозможным. Постиндустриальная стадия развития человечества нацелена на высокие технологии, инновации во всех сферах.
Особенно быстро развивается медицина: большинство болезней, считавшихся ранее неизлечимыми, теперь таковыми не являются. Так, например, культивирование вирусов позволяет создавать профилактические препараты: вакцины и сыворотки, предотвращающие эпидемии чумы, оспы и других смертельно опасных болезней.
Что такое культивирование?
Культивирование (от лат. cultivo – возделывать) представляет собой процесс разведения и выращивания чего-либо в искусственных условиях. В медицине, а точнее в эпизоотологии – частном ответвлении от ветеринарной медицины, культивирование является основным процессом, позволяющим изучать воздействие вируса на живой организм.
На основании полученной информации фармацевты изготавливают противовирусные препараты, создают методики, позволяющие в будущем противодействовать выявленным микроорганизмам. Выделение вирусов из зараженного материала также позволяет сохранять их для дальнейшего использования.
История эпизоотологии
Еще в 1879 году французский ученый В. Гальтье впервые предпринял попытку культивировать вирус. Его выбор пал на такое заболевание, как бешенство: он выделил неклеточный агент этой болезни посредством заражения кролика кровью больной собаки.
В 1919 году у немца А. Левенштейна получилось заразить вирусом герпеса, взятым у человека, кролика. Годом позже его соотечественник В. Грютер подтвердил опыт своего коллеги и доказал, что подобная культивация на кроликах возможна.
В 1925 году двое ученых – Ф. Паркер и Б. Най – доказали, что вирус коровьей оспы в состоянии воспроизводиться в тканях организма животных. 6-ю годами позже Вудрафф и Э. Гудпасчер заявили, что культивация вируса оспы птиц может проводиться на оболочке куриных эмбрионов, тем самым открыв научному миру новый метод репродукции вирусов.
Процесс заражения клетки
Процесс культивирования вируса невозможен без наличия реагирующей на него клетки. Когда клетка найдена (это могут быть клетки куриных эмбрионов, части тканей, органов или даже целые животные), в нее вводится нуклеиновая кислота вируса, которая перепрограммирует генетическую информацию искомой клетки, заменяя ее своей. Обычно вредоносной частице удается поселиться в клетке, даже несмотря на систему противовирусной защиты и вырабатываемые организмом интерфероны.
После того как вирус проник через мембрану клетки, он начинает размножаться, проходя через 3 стадии. Сначала происходит транскрипция генома закрепившегося вируса, что означает перенос информации из системы ДНК в РНК, которая в последующем синтезируется в ускоренном темпе. Следующий этап – образование и созревание белков, которые послужат каркасом для дочерних вирусных тел.
На последней, заключительной стадии новосинтезированные вирусные тела увеличиваются в количестве. Когда их становится слишком много, разрывают мембрану и выходят из клетки, в которой изначально закрепился вирус. Стоит отметить, что образование вирионов (дочерних тел данного микроорганизма) не всегда приводит к гибели клетки-хозяина. Некоторые способны отпочковываться от мембраны, не вызывая ее разрыва, в то время как клетка продолжает производить вирусные тела.
Микробиология и ее методы
С течением времени биология, как наука, развивалась и впитывала в себя новые факты. Постепенно усложняясь, от нее стали отпочковываться разные направления: биомеханика, гидробиология, вирусология, космическая биология и многие другие. Такой раздел, как микробиология, изучает процессы жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе и посредством заражения подопытного лабораторного животного вирусом. Таким образом, в микробиологии культивирование вирусов считается одним из основных способов получения информации, являясь ключевым инструментом биологического метода исследования.
Помимо биологического метода, суть которого заключается в исследовании действия вируса на организм животного и последующей его культивации, существуют и некоторые другие. Во многих случаях вредоносными микроорганизмами заражают куриные эмбрионы, поскольку довольно крупная доля вирусов, известных на сегодняшний день науке, способна реплицироваться именно в этой форме жизни. Однако чаще всего биологи в качестве рабочего материала используют тканевые культуры, поскольку они наиболее продуктивны в качестве метода культивирования.
Вирус и тканевые культуры
Тканевая культура представляет собой некую систему клеток в виде суспензии. Это слой определенного размера, обычно в одну клетку, который помещается на стекло сосуда. Чаще других используется первичная монослойная ткань. Добиться монослойности довольно трудно, сначала выбранную ткань (обычно это ткань сердца, плаценты или почек животных) нужно измельчить.
После измельчения биологи применяют расщепляющий белок фермент – трипсин, который разъединяет клетки ткани, уничтожая между ними межклеточную связь. После достижения разъединения клеток необходимо отмыть их от фермента и поместить в питательную среду, чтобы обеспечить рост получившейся клеточной культуры. Данной средой может послужить среда 199, которая характерна высоким содержанием глюкозы, солей и разных витаминов. Меняется питательная среда по прошествии 2–3 дней.
Кроме первичной ткани для культивирования вирусов также применяются так называемые перевариваемые ткани, которые, в свою очередь, делятся на нормальные и опухолевые. Они более стойкие, чем первичные, и способны длительно размножаться. Нормальными тканями могут послужить органы животных: почки барана, сердце обезьяны. В качестве опухолевых тканей обычно берут клетки HeLa, выделенные изначально из рака шейки матки, или клетки Hep-3, взятые из рака лимфы.
Вирус и куриные эмбрионы
Большинство известных науке вирусов можно выращивать в куриных эмбрионах. Они очень жизнеспособны и устойчивы к негативным внешним воздействиям. Срок, на котором заражается эмбрион, зависит от задач исследования и вида вируса, но обычно не превышает двух недель. Так, например, чтобы провести культивирование вируса гриппа, нужен 9-10-дневный эмбрион, а для того чтобы вырастить вирус паротита, достаточно и недельного эмбриона.
При работе с куриным эмбрионом все его зачатки тканей подвергаются заражению. Результативность культивации можно увидеть на финальной стадии: это может быть гибель эмбриона, а также дефекты развития в виде появления на оболочках эмбриона бляшек, состоящих из вирусных частиц – вирионов.
В любом случае данный метод культивирования и индикации вирусов имеет существенный недостаток, заключающийся в необходимости вскрытия эмбриона для захвата воспроизведенного вируса. Также полученная субстанция имеет в себе высокую концентрацию белка, который нужно удалить, чтобы вывести чистый инфекционный агент для дальнейшего производства медикаментов.
Вирус и организмы животных
В настоящее время использование лабораторных животных в качестве биологического материала в силу своей негуманности ограничено с 1986 года Европейской конвенцией о защите позвоночных животных. Несмотря на это, многие виды животных: мыши и крысы, хорьки и кролики, овцы, собаки и обезьяны – все равно используются в лабораторных работах и экспериментах, поскольку некоторые вирусы способы к репликации только в живых организмах.
Культивирование вирусов в организме животных проводится по-разному: для воспроизведения нейротропных вирусов (бешенство, энцефалит) заражается мозг животного, для создания респираторных (грипп) производится интраназальное заражение, для дерматотропных (оспа) – накожное и подкожное инфицирование.
Чаще прочих для культивации используются грызуны: мыши и крысы, сирийские хомячки, свинки. Их заражают нейротропными инфекционными агентами, аденовирусами, лимфоцитарным хориоменингитом посредством введения вредоносного микроорганизма в мозг или брюшную полость.
Некоторые вредоносные микроорганизмы гораздо быстрее развиваются в телах молодых особей, поэтому онкогенными вирусами заражаются в основном новорожденные крысы и сирийские хомячки. Без них также невозможно обойтись при культивации вирусов Коксаки. Стоит отметить, что биологический метод культивирования вирусов в микробиологии тоже имеет свои изъяны. Во-первых, организмы лабораторных животных загрязняются вирусами, в силу чего они испытывают недомогание. Во-вторых, чтобы получить чистый инфекционный агент, нужно провести его через другие культуры клеток, что увеличивает продолжительность исследования.
Показатели успеха заражения
Культивирование и индикация вирусов – два неразрывных процесса. Индикация позволяет понять, смог ли микроорганизм ужиться в зараженной клетке и получилось ли у него развиваться дальше. Говорить о факте репликации можно, если у животного наблюдаются основные признаки заболевания, а также если органы и ткани подверглись патоморфологическим изменениям. Часто в качестве индикации используется реакция гемагглютинации, которая показывает степень распространения вируса на основе выделяемого им белка гемагглютинина.
Современные особенности культивирования вирусов
Прогресс не стоит на месте, во всех научных сферах появляются инновационные методы, технологии. Микробиология и вирусология не являются исключением. Теперь вместо простого размещения клеточной культуры на сосудах применяется роллерный метод, при котором используемый материал находится на нескольких цилиндрических поверхностях, вращающихся по окружности и периодически омываемых питательной средой. Данный метод хорош тем, что он увеличивает число получаемых клеток и требует меньший расход питательного материала.
Общий вывод
Культивировать вирусы, то есть создавать их в искусственных средах, человек начал совсем недавно. Поначалу заражались организмы животных с целью изучения принципа действия инфекционных агентов и выработки препаратов против них. Благодаря микробиологии, вирусологии и эпизоотологии человечество избавилось от таких смертельной опасности таких заболеваний, как чума, туберкулез, бешенство, корь.
Сейчас для культивации вирусов в основном используются отдельные тканевые культуры и куриные эмбрионы. Посредством различных манипуляций живые клетки заражаются, в них происходит созревание вирусных тел, которые потом выходят за клеточное пространство. Созревшие вирусы собираются биологами для дальнейшего изучения.
