Аффинная хроматография в медицине: особенности и применение

Хроматография – это один из методов разделения веществ. Она используется для последующего качественного и количественного анализа физических и химических свойств микрочастиц. Разновидностью данной технологии является аффинная хроматография. Идея дифференциации белковых соединений с использованием свойства сродства молекул известна в науке уже несколько десятилетий. Однако свое развитие она получила только в последние годы, после того, как были внедрены высокопористые гидрофильные материалы, использующиеся в качестве матрицы. Данный метод позволяет решать как аналитические задачи (разделение веществ и их идентификация), так и препаративные (очистка, концентрирование).

Сущность

Аффинная хроматография (от латинского слова affinis – «смежный», «родственный») основана на аффинных взаимодействиях, которые представляют собой образование высоко специфических связей между молекулой-разделителем (лигандом или аффинантом) и целевой молекулой. Эти механизмы широко распространены в природе (связь медиаторов или гормонов и рецепторов, антител и антигенов, гибридизация полинуклеотидов и другие виды процессов). В медицине аффинная хроматография начала применяться в практических целях начиная с 1951 г.

Разделение компонентов происходит следующим образом:

• рабочий раствор, содержащий вещество, которое необходимо выделить, пропускают через сорбент;
• лиганд, нанесенный на матрицу-сорбент, удерживает это вещество;
• происходит его концентрирование (накопление);
• извлечение выделенного вещества с сорбента при помощи вымывания растворителем.

Данный способ позволяет выделить целые клетки. Отличием от традиционной сорбционной хроматографии является то, что существует прочное биоспецифическое связывание выделяемого компонента с сорбентом, характеризующееся высокой избирательностью.

Адсорбенты

В качестве адсорбентов применяют следующие вещества:

• Гелеобразные составы на основе агарозы – полисахарида, получаемого из агара. Наиболее часто используют 3 разновидности: сефарозу 4 В, CL (сшитая агароза) и аффи-гель. Последний состав представляет собой модифицированный гель из агарозы и полиакриламида. Он обладает большей биологической инертностью, высокой химической и термической стойкостью.
• Кремнезем (силикагель).
• Стекло.
• Органические полимеры.

Для устранения механических препятствий при контакте лиганда применяют дополнительные вещества, отделяющие его от носителя (пептиды, диамины, полиамины, олигосахариды).

Аппаратура

Оборудование для аффинной хроматографии включает в свой состав следующие основные узлы:

• емкости-накопители для подвижной фазы (элюента);
• насосы высокого давления для подачи среды (чаще всего поршневые);
• фильтр для очистки элюентов от пыли;
• дозирующее устройство;
• хроматографическая колонна для разделения смеси;
• детектор для определения разделенных компонентов, выходящих из колонны;
• регистраторы хроматограмм и микропроцессорный блок (ЭВМ).

С целью уменьшения количества растворенного воздуха через подвижную фазу предварительно пропускают гелий. Для изменения концентрации элюента устанавливают несколько насосов, управляемых программатором. Хроматографические колонны изготавливаются из нержавеющей стали (при повышенных требованиях к коррозионной устойчивости), из стекла (универсальный вариант) или из акрила. Для препаративных целей их диаметр может колебаться от 2 до 70 см. В аналитической хроматографии применяют микроколонки Ø10-150 мкм.

Для повышения чувствительности детекторов в смесь вводятся реагенты, которые способствуют образованию веществ, которые больше поглощают лучи в ультрафиолетовой или видимой области спектра.

Методика проведения

Различают 2 основных вида жидкостной аффинной хроматографии:

• Колоночная, при которой колонну заполняют неподвижной фазой и через нее пропускают смесь с потоком элюента. Разделение может происходить под давлением или под в результате действия силы тяжести.
• Тонкослойная. Элюент движется по плоскому слою адсорбента под воздействием капиллярных сил. Адсорбент наносят на пластину из стекла, керамическую или кварцевую палочку, металлическую фольгу.

Основные этапы работ включают в себя:

• подготовка адсорбента, фиксация лиганда на носителе;
• подача смеси для разделения в хроматографическую колонну;
• загрузка подвижной фазы, связывание компонента лигандом;
• замена фазы для выделения связанного вещества.

Назначение

Аффинная хроматография используется для выделения следующих видов веществ (в скобках указан вид применяемого при этом лиганда):

• аналоги ферментативных ингибиторов, субстратов и кофакторов (ферменты);
• биоорганические вещества, обладающие признаками генетической чужеродности, вирусы и клетки (антитела);
• высокомолекулярные углеводы, полимеры моносахаридов, гликопротеины (лектины);
• ядерные белки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеиновые кислоты);
• рецепторы, транспортные белки (витамины, гормоны);
• белки, взаимодействующие с клеточными мембранами (клетки).

Эта технология также используется для получения иммобилизованных ферментов, а привязка их к целлюлозе позволяет изготовить иммуносорбенты.

Хроматография ДНК-связывающих белков

Выделение ДНК-связывающих белков производится с помощью гепарина. Этот гликозаминогликан способен связывать большой диапазон молекул. Аффинная хроматография белков данной группы используется для выделения таких веществ, как:

• факторы инициации и элонгации трансляции (синтез молекул нуклеиновых кислот и белков);
• рестриктазы (ферменты, узнающие определенные последовательности в двухцепочечной ДНК);
• ДНК-лигазы и полимеразы (ферменты, катализирующие соединение двух молекул с образованием новой химической связи и участвующие в репликации ДНК);
• ингибиторы сериновых протеаз, которые играют важную роль в иммунных и воспалительных процессах;
• факторы роста: фибробластов, Шванна, эндотелиальный;
• белки межклеточного матрикса;
• рецепторы гормонов;
• липопротеиды.

Достоинства

Данный метод является одним из самых специфических для выделения реакционноспособных соединений (ферментов и более крупных агрегатов – вирусов). Однако он используется не только для выделения биологически активных веществ.

Выявление антител в малых количествах, количественная оценка полиадениловой кислоты, экспресс-определение молекулярных масс дегидрогеназ, удаление определенных загрязнителей, изучение кинетики активации неактивной формы трипсина, молекулярного строения интерферонов человека – вот далеко не весь перечень исследований, при которых применяется аффинная хроматография. Применение в клинике обусловлено такими ее преимуществами, как:

• Возможность эффективной очистки белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот. Они незначительно отличаются по своим физико-химическим свойствам и теряют активность при гидролизе, денатурации и прочих видах воздействия, используемых в других методах.
• Быстрота разделения веществ, динамический характер процесса.
• Отсутствие необходимости в специальной очистке ферментов и гомогенизации изоферментов для определения констант диссоциации.
• Возможность разделения широкого круга веществ.
• Небольшой расход лигандов.
• Возможность разделения веществ в больших объемах.
• Обратимый процесс связывания биологических макромолекул.

Данную методику можно совмещать с другими, накладывать дополнительное поле (гравитационное, электромагнитное). Это позволяет расширить технические возможности хроматографии.

Ферментная инженерия

Благодаря этому методу началось активное развитие новой отрасли биотехнологий – ферментной инженерии.

Аффинная хроматография применительно к выделению ферментов обладает следующими преимуществами:

• получение ферментов в больших количествах в результате меньших затрат времени, как результат – их удешевление;
• иммобилизация ферментов позволяет значительно расширить область их применения в медицине и промышленности;
• связь ферментов с нерастворимой твердой подложкой дает возможность изучить влияние микроокружения и направление реакций, которые играют важную роль в природных и физиологических процессах.