Молекулярная масса белков и методы ее определения

Методы нахождения молекулярной массы белка бывают химическими, физико-химическими и физическими. Самыми распространенными физико-химическими методами являются гель-хроматография (как колоночная, так и тонкослойная) и электрофорез в среде полиакриламидного геля в присутствии натрия додецилсульфата. Они не требуют сложного оборудования и больших количеств исследуемого материала.

Характеристика белков

Белки представляют собой высокомолекулярные полимеры биологического происхождения. Они состоят из аминокислот, соединенных последовательно пептидными связями. Размеры белков зависят от количества этих самых аминокислот. Средние значения элементного состава белков в %:

• углерода – в интервале 50,6-54,5;
• кислорода – в пределах 21,5-23,5;
• азота – около 15,0-17,6;
• водорода –в интервале 6,5-7,3;
• серы – в пределах 0,3-2,5;
• минеральных веществ – не более 0,5.

Белки подразделяют на простые, состоящие только из остатков аминокислот, и сложные, включающие простетические группы. Небелковые компоненты могут быть углеводами, липидами, нуклеиновыми кислотами, производными витаминов, ионами металлов, гемом и др. Различают четыре структуры белков.

Аминокислотный состав белков находят путем кислотного гидролиза, сочетаемого с последующим разделением освободившихся аминокислот с помощью ионообменной хроматографии.

Количественные показатели каждой из аминокислот определяют нин-гидриновым методом. Выявление размещения аминокислот в молекуле белка осуществляют путем последовательного отщепления концевых аминокислот с помощью ферментов и их идентификацией, что позволяет определить структуру белковой молекулы. Идентификация основана на их различных физико-химических свойствах. Нередко для этого используют цветные реакции на те или иные аминокислоты и хроматографию.

Колоночная гель-хроматография

Этот метод основывается на линейной зависимости логарифма молекулярной массы многих глобулярных белков и объема элюирования с заполненной гелем (определенного размера пор). Таким образом, для определения молекулярной массы белка следует лишь найти объем его элюции с откалиброванной заранее колонки. Калибровку выполняют методом пропускания через колонку белков с заранее известными массами молекул и замеряя объемы элюции каждого из них. Если в качестве заполнителя используют сефадекс G-75, то расчет молекулярной массы ведут по найденному экспериментальным путем уравнению:

lg M = 5,624 – 0,752 · (V_э / V_o),

где М – искомая молекулярная масса; V_э – выходящий из колонки объем раствора с исследуемым веществом; V_o – объем свободной колонки.

Для проведения анализа понадобятся раствор голубого декстрана (1%), раствор NaCl (0,1 моль/л), сефадекс G-75 (4 г), раствор гемоглобина (1%).

Выполнение анализа

Подготовленную колонку заполняют гелем сефадекса G-75 и промывают раствором NaCl. После того как сольют раствор NaCl, поднимающийся выше уровня геля, на его поверхность аккуратно помещают 0,5 мл раствора голубого декстрана. Затем собирают выходящие из колонки жидкости в мерный цилиндр, где их сохраняют до конца эксперимента. Начинающий вытекать раствор с голубой окраской собирают по 20 капель в подготовленные заранее пробирки. Элюат из них от первого до самого интенсивно окрашенного сливают в тот же мерный цилиндр, в котором уже собраны неокрашенные фракции. Объем пробирок ослабевающей окраской раствора не учитывают.

Объем жидкости, собранной в мерный цилиндр, составляется свободным объемом колонки (V_o). Далее повторяют заполнение колонки, но вместо голубого декстрина используют раствор гемоглобина. Объем элюата в мерном цилиндре до выхода раствора с максимально розовой окраской является величиной V_э. Найденные значения V_o и V_э подставляют в соответствующее уравнение и вычисляют массу белка. Аминокислотный состав белков находят подобными методиками.

Тонкослойная гель-хроматография

Принцип этого метода заключается в том, что в ходе продвижения раствора белков по пластине с тончайшим слоем сефадекса, смесь их распределяется неравномерно. По расстоянию, пройденному каждым из белков от исходной стартовой линии, находят логарифмы их молекулярных масс. Для определения молекулярной массы белка методом тонкослойной гель-хроматографии строят калибровочный график, отражающий зависимость пройденных маркерными белками расстояний от логарифмов их молекулярных масс. Уже по нему находят длину пути исследуемого белка и массу его молекулы.

Для выполнения эксперимента потребуется столик с изменяющимся углом наклона, а также хроматографическая камера. Из реактивов понадобятся сефадекс G-200 или G-150, натрий-фосфатный буфер, pH 7,4 (0,1 моль/л), раствор бромфенолового синего (0,1%), раствор СН₃СООН (5%), раствор CH₃COONa (2 %), набор маркерных белков, хроматографическая бумага.

Выполнение эксперимента

Сначала необходимо приготовить гель сефадекса, для чего сухую его массу 4 г суспендируют в избыточном количестве натрий-фосфатного буфера, а затем оставляют для набухания в течение 3 суток при н.у. Стеклянную пластинку со сторонами 20х40 см тщательно промывают. Перед нанесением на нее сефадекса буфер над ним декантуют, а затем гель хорошо перемешивают. На горизонтально расположенную пластину его наносят фарфоровой ложечкой, а затем распределяют прокатыванием стеклянной палочки размером 1х22 см. Прокатывание повторяют до равномерного распределения слоя геля без комков и пузырьков толщиной 1 мм. Подготовленную пластинку просушивают на воздухе 15 мин., а потом помещают в хроматографическую камеру.

В крайние емкости заливают фосфатный буфер, гель соединяют с буфером хроматографической бумагой. Далее камеру закрывают и помещают на специальную подставку. Угол ее наклона устанавливают на 7-10°. Для насыщения камеру оставляют на ночь.

Растворы белков, молекулярная масса которых известна, так же, как и исследуемые образцы, наносят микропипеткой, объем каждой порции должен быть по 0,02 мл. Пластинку возвращают в горизонтальное положение и наносят порции белка в определенные точки. Расстояние между ними и от верхнего края должно быть 3 см. Затем камеру закрывают и ставят под углом 7–10°. Гель-хроматографический анализ проводят 4 ч.

По истечении отведенного времени камеру ставят горизонтально, хроматографическую бумагу удаляют. Стеклянную пластинку помещают на подставку в горизонтальном положении и снимают "реплику" на бумагу для хроматографии. Для этого ее сворачивают в трубочку и накладывают на тонкий гелевый слой, постепенно разворачивая. При этом бумага должна прилипнуть к нему, но делать это нужно аккуратно, чтобы сохранить его в целости. Бумагу оставляют на поверхности пластинки 1 мин., после этого высушивают при температуре 90 °С 20 мин. и помещают в специальную кювету для окрашивания.

Расшифровка результатов

Чтобы идентифицировать белковые зоны, "реплику" помещают в раствор бромфенолового синего на 3 минуты. Далее краситель нужно отмыть дважды раствором уксусной кислоты и закрепить ацетатом натрия. После этого хроматографическую бумагу тщательно промывают в холодной проточной воде и высушивают. Далее приступают к измерению расстояния, пройденного каждым белком от исходной точки до центра пятна.

По полученным данным выстраивают калибровочный график, путем откладывания по оси абсцисс l_а/l_ст (где индекс а относится к анализируемому, а ст - к стандартному белку), по оси ординат – lgM. Замерив расстояние белковой области исследуемого образца от старта, по выстроенному графику определяют молекулярную массу и предполагаемую структуру белковой молекулы.