ПЦР в реальном времени - революция в молекулярной диагностике

ПЦР в реальном времени - технология, которая навсегда изменила лицо молекулярной биологии и медицинской диагностики. Этот метод позволяет за считанные часы с невероятной точностью обнаруживать мельчайшие количества ДНК возбудителей заболеваний, мутаций и патологических клеток. Давайте разберемся, как устроена эта революционная технология и как она вытеснила устаревшие методы анализа ДНК.

История создания метода ПЦР в реальном времени

В 1983 году американский биохимик Кэри Мюллис разработал метод полимеразной цепной реакции, который позволял быстро амплифицировать определенные фрагменты ДНК в пробирке. Это изобретение принесло ему Нобелевскую премию и навсегда изменило молекулярную биологию. Однако первоначальный метод ПЦР имел существенный недостаток – для детекции продуктов амплификации требовалось проводить электрофорез в агарозном геле, что занимало много времени и не давало количественных результатов.

В начале 1990-х годов появились первые публикации о возможности проводить ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени. Для этого использовались флуоресцентные красители, связывающиеся с двуцепочечной ДНК, или флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды.

В 1996-1997 годах компании Roche и Applied Biosystems выпустили на рынок первые коммерческие наборы реагентов и приборы для ПЦР в реальном времени. Это позволило распространить технологию в научных лабораториях и клинических центрах.

К 2000-м годам ПЦР в реальном времени практически полностью вытеснила традиционную ПЦР и стала основным методом анализа ДНК.

Принцип работы ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени основана на тех же принципах, что и обычная ПЦР – амплификации определенного участка ДНК с помощью праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы. Отличие заключается в способе детекции продуктов амплификации.

В традиционной ПЦР для этого требуется проводить электрофорез ампликонов. В ПЦР-РВ детекция осуществляется непосредственно в пробирке после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных меток.

Для этого используются два основных подхода:

• Интеркалирующие красители, например SYBR Green, которые связываются с любой двуцепочечной ДНК и увеличивают флуоресценцию.
• Специфические флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions), которые гибридизуются только с комплементарным участком ампликона.

Измеряя уровень флуоресценции в каждом цикле, можно в реальном времени оценить количество накопившегося продукта. Чем больше исходного вещества было в пробе, тем быстрее флуоресценция поднимется над порогом детекции.

Таким образом, по числу циклов, необходимых для появления сигнала, можно судить о концентрации ДНК в образце. Этот показатель называется Ct (cycle threshold).

Преимущества ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени имеет целый ряд достоинств по сравнению с классической ПЦР:

• Высокая чувствительность, способность детектировать всего несколько копий ДНК в пробе.
• Быстрота получения результата - нет необходимости в электрофорезе после ПЦР.
• Количественный результат - возможность точно оценить, а не просто качественно детектировать ДНК.
• Низкий риск контаминации, так как нет этапа вскрытия пробирок после амплификации.
• Высокая степень автоматизации процесса, меньшая потребность в ручном труде.

Эти преимущества объясняют, почему ПЦР-РВ вытеснила традиционную ПЦР в большинстве областей применения, от научных исследований до медицинской диагностики.

Области применения ПЦР в реальном времени

Благодаря своим уникальным преимуществам, ПЦР в реальном времени нашла широкое применение в самых разных областях:

• Диагностика инфекционных заболеваний. ПЦР-РВ позволяет обнаруживать ДНК или РНК возбудителей вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных инфекций. Это делает ее идеальным инструментом для экспресс-диагностики и мониторинга лечения.
• Выявление онкологических заболеваний. Определение мутаций, характерных для разных типов рака, циркулирующих опухолевых клеток и маркеров метастазирования с помощью ПЦР-РВ повышает точность диагностики и позволяет подобрать наиболее эффективную терапию.

Генетическая диагностика

Благодаря высокой чувствительности, ПЦР-РВ стала основным методом выявления наследственных заболеваний, связанных с мутациями в генах.

• Исследование экспрессии генов. Количественный ПЦР-анализ уровней мРНК дает точную картину активности разных генов в клетках. Это незаменимый инструмент для изучения регуляции экспрессии генов.
• Контроль пищевых продуктов и сырья. Высокочувствительная ПЦР-РВ используется для выявления патогенных микроорганизмов, ГМО, аллергенов и других примесей в пище и сельхозсырье.

Методы детекции продуктов ПЦР

Существует несколько различных методов детекции, используемых в ПЦР в реальном времени:

• Интеркалирующие красители. Наиболее простой и дешевый метод - использование неспецифических красителей вроде SYBR Green, которые повышают флуоресценцию при связывании с двуцепочечной ДНК.
• Специфические флуоресцентные зонды. Более дорогой, но и более специфичный подход - применение флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions), комплементарных определенному участку ампликона.

Анализ кривых плавления

При использовании SYBR Green можно проводить анализ температуры плавления продуктов для проверки их специфичности. Количественный анализ результатов ПЦР в реальном времени. Результаты ПЦР в реальном времени могут анализироваться двумя основными способами:

• Абсолютная количественная оценка. При абсолютном количественном анализе строится калибровочная кривая по образцам с известным количеством ДНК. Затем по положению на кривой определяют концентрацию ДНК в исследуемых пробах.
• Относительная количественная оценка. При относительном анализе количество целевой ДНК сравнивают с количеством референсного "домашнего" гена, экспрессия которого постоянна.

Выражение результата

Конечный результат может быть выражен как абсолютное число копий ДНК на мл пробы или на 1 мкг ткани. Также часто используют значение порогового цикла Ct.

• Анализ мазков. Для диагностики COVID-19 методом ПЦР-РВ анализируют мазки из носоглотки пациентов.
• Детектируемые гены. В качестве мишеней используют гены ORF1ab и N коронавируса SARS-CoV-2.

Интерпретация результатов

Положительным считается результат с Ct менее 37 циклов, отрицательным - Ct более 40 циклов.

• Снижение стоимости. Ожидается дальнейшее удешевление оборудования и наборов реагентов.
• Повышение мультиплексности. Разработка методов для одновременного анализа большего числа ДНК-мишеней.
• Миниатюризация. Создание компактных портативных устройств для экспресс-тестирования.

Ограничения метода ПЦР в реальном времени

Несмотря на многочисленные достоинства, у ПЦР в реальном времени есть и определенные недостатки:

• Высокая стоимость. ПЦР-РВ требует дорогостоящего оборудования и реагентов, что ограничивает ее широкое применение.
• Трудоемкая оптимизация. Для мультиплексного анализа необходима тщательная оптимизация условий ПЦР и праймеров.

Риск контаминации

Высокая чувствительность метода требует тщательных мер по предотвращению контаминации реагентов и проб.

• Невозможность количественной оценки без стандартов. Для абсолютного количественного анализа необходимо использование стандартных образцов с известным содержанием ДНК.
• Персонализированная медицина. Анализ полиморфизмов, мутаций, уровней экспрессии генов для подбора терапии под конкретного пациента.

Метагеномика

Исследование состава микробиома человека и его роли в развитии заболеваний.

• Контроль биобезопасности. Выявление опасных вирусов, бактерий и токсинов в окружающей среде и пищевых продуктах.
• Судебно-медицинская экспертиза. Идентификация личности и родства по следам ДНК с помощью ПЦР-РВ.

Интеграция ПЦР в реальном времени с другими методами

• Сочетание с секвенированием. ПЦР-РВ часто используется для предварительного обогащения библиотек перед секвенированием нового поколения. Это повышает чувствительность и специфичность секвенирования.
• Комбинация с иммуноферментным анализом. Одновременное выявление антигенов и нуклеиновых кислот возбудителя методом ИФА и ПЦР-РВ повышает достоверность диагностики.
• Совмещение с масс-спектрометрией. Использование ПЦР-РВ для получения ДНК, а масс-спектрометрии для ее идентификации, увеличивает возможности анализа.
• Комбинация с микрочипами. ПЦР-РВ в сочетании с ДНК-микрочипами позволяет проводить массовый параллельный анализ сотен генов.

Совмещение с иммуногистохимией

Одновременный анализ экспрессии белков и нуклеиновых кислот дает комплексную картину состояния тканей и клеток.

• Автоматизация и роботизация ПЦР в реальном времени. Автоматическая подготовка проб. Использование роботизированных станций для выделения нуклеиновых кислот из образцов.
• Автоматическое планирование экспериментов. Программное обеспечение для оптимального подбора условий ПЦР и праймеров.

Полная автоматизация процесса проведения ПЦР на специализированных роботизированных платформах. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) - революционная технология амплификации и детектирования ДНК, которая за считанные часы способна выявлять единичные копии молекул ДНК.