Проточная цитофлуориметрия - сущность и применение

Проточная цитофлуориметрия – это цитологический метод исследований, применяющийся для углубленного анализа клеток. Его преимуществом является то, что он позволяет изучить каждую клетку в отдельности. Данный вид анализа помогает произвести оценку нескольких параметров у сотен клеток за считанные секунды. Благодаря этому цитофлуориметрия считается одним из наиболее быстрых и точных способов анализа, которые доступны ученым и клиницистам в настоящее время.

Принцип

Принцип метода проточной цитофлуориметрии основан на измерении рассеивания света и свечения (флуоресценции) клеток. Клеточную суспензию пропускают в виде потока с большой скоростью через ячейку цитометра, где происходит ее облучение лазером. Там же производится, так называемая гидродинамическая фокусировка. Ее механизм заключается в том, что поток из ячейки с изучаемыми частицами на выходе вливается во внешнюю струю, которая обладает большей скоростью. В результате происходит выстраивание частиц в упорядоченную цепочку.

Предварительно клетки метят специальными флуоресцирующими красителями (флуорохромами). Благодаря им лазерный луч возбуждает вторичное свечение. Полученные световые сигналы регистрируются детекторами. В последующем информация обрабатывается при помощи программных алгоритмов, которые позволяют подсчитать отдельные популяции клеток, различающиеся по каким-либо критериям.

Исследование с помощью традиционной микроскопии часто не позволяет отличить разные клетки, так как они одинаково выглядят. Цитофлуориметрия может предоставить и другие данные (целостность структуры ДНК), провести анализ экспрессии белков, выживаемости клеток.

Так как для возбуждения флуорохромов нужны световые лучи с разной длиной волны, а также разные типы детекторов, то современные установки оснащены несколькими каналами детекции (от 4 до 30). Количество лазерных излучателей может быть от 1 до 7. Более сложные по составу устройства позволяют осуществлять многопараметрические исследования сразу нескольких свойств частиц.

Преимущества и недостатки

К преимуществам проточной цитофлуориметрии относятся следующие:

• высокая скорость обработки (регистрация до 30 тысяч событий за 1 секунду);
• возможность исследования большого числа клеток (до 100 млн. в образце);
• количественная оценка интенсивности флуоресцентного излучения;
• анализ каждой из клеток;
• одновременное исследование разнородных процессов;
• автоматическое разделение данных по популяциям клеток;
• качественная визуализация результатов.

Еще одной особенностью этой технологии является то, что анализируемую частицу допускается окрашивать несколькими флуоресцентными растворами. Благодаря этому происходит многопараметрическое исследование.

К недостаткам можно отнести сложность технического оборудования и необходимость специальной подготовки пробы.

Цитометры

Первые устройства такого типа появились уже в 1968 году в Германии, но широкое распространение они получили гораздо позднее. В настоящее время все приборы, работающие по методу проточной цитофлуориметрии, можно разделить на 2 типа:

• устройства, что измеряют флуоресцентное излучение (две и более длины волны), рассеяние света под углом 10 и 90° (детектор малоуглового и бокового рассеяния);
• аппараты, которые, помимо измерения нескольких клеточных параметров, автоматически производят сортировку на группы в соответствии с этими критериями.

Детектор прямого светорассеяния предназначен для определения размеров клетки, а устройство для регистрации бокового светорассеяния позволяет получить информацию о наличии внутриклеточных гранул, объемного соотношения цитоплазмы и ядра.

Классические цитометры, в отличие от световых микроскопов, не позволяют получить изображение клетки. Однако в последние годы разработаны комбинированные устройства, которые способны совмещать возможности микроскопа и цитофлуориметра. Речь о них пойдет ниже.

Визуализирующие цитометры

Для приборов, использующихся в классической проточной цитофлуориметрии, характерна одна особенность: если в популяции анализируемых клеток зарегистрированы редкие события, то нет возможности оценить, какова их суть. Эти частицы могут оказаться как останками умерших клеток, так и их редкой группой. В обычных аппаратах такие данные исключаются из общего потока событий, однако именно они могут представлять особую ценность для научного и клинического анализа.

Визуализирующие проточные цитометры нового поколения позволяют зафиксировать изображение каждой клетки, проходящей в потоке через зону детектора. Его легко увидеть, нажав на соответствующую область диаграммы, которая выводится на монитор компьютера.

Сферы применения

Проточная цитофлуориметрия – универсальный метод, который применяется во многих областях медицины и науки:

• иммунология;
• онкология;
• трансплантология (трансплантация красного костного мозга, стволовых клеток);
• гематология;
• токсикология;
• биохимия (измерение кислотности внутри клетки, исследование других параметров);
• фармакология (создание новых лекарств);
• микробиология;
• паразитология и вирусология;
• океанология (изучение фитопланктона для оценки состояния водоемов и другие задачи);
• нанотехнологии и анализ микрочастиц.

Иммунология

Иммунная система человека состоит из большого количества разнообразных клеток. Проточная цитофлуориметрия в иммунологии позволяет оценить их структуру и функции, то есть провести морфофункциональный анализ.

Такие исследования помогают изучить сложную природу иммунитета. Фенотипы клеток меняются в результате активации антигенами, развития патологий и других факторов. Цитофлуориметрия может разделить субпопуляции иммунных клеток в сложной смеси и оценить все их изменения в динамике.

Онкология

Одной из важнейших задач в онкологии является дифференцирование клеток по их типу. Принцип анализа по методу проточной цитофлуориметрии в онкогематологии основан на следующем явлении: при обработке пробы специальным флуоресцентным красителем происходит его связывание с белками цитоплазмы. После деления в активно пролиферирующих клетках происходит снижение его содержания в два раза. Соответственно, двукратно уменьшается и интенсивность свечения клеток.

Существуют и другие способы выявления пролиферирующих клеток:

• использование ДНК-связывающих красителей (йодид пропидия);
• применение меченого урацила;
• регистрирование повышенного уровня экспресии белков циклинов, которые участвуют в регуляции клеточного цикла.