Гель-фильтрация: понятие, принцип работы, методы проведения и практическое применение
Гель-фильтрация – один из наиболее эффективных методов разделения веществ по размерам молекул. В этой статье вы узнаете, как с помощью простой химической установки отделить нужные соединения от примесей.
1. Понятие гель-фильтрации
Гель-фильтрация – это разновидность хроматографии, при которой молекулы веществ разделяются по размерам за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы – геля. Чем крупнее молекула, тем быстрее она проходит сквозь колонку, не заходя в поры геля. Мелкие молекулы просачиваются внутрь гранул геля и движутся медленнее.
Метод гель-фильтрации был разработан в 1950-х годах. Он быстро завоевал популярность благодаря простоте исполнения и мягким условиям разделения, позволяющим сохранить структуру белков и других лабильных соединений.
Главные преимущества гель-фильтрации:
- Высокая эффективность
- Разделение веществ в мягких условиях
- Легкость масштабирования
- Возможность разделения смесей с широким диапазоном молекулярных масс
2. Физико-химические основы гель-фильтрации
В гель-фильтрации используют гели на основе декстрана, агарозы или акриламида. Эти гидрофильные полимеры образуют трехмерную сетку с порами определенного размера. Поры заполнены водой или буферным раствором – подвижной фазой.
Молекулы разделяемой смеси перемещаются с разной скоростью в зависимости от способности проникать в поры геля:
- Крупные молекулы движутся быстрее всего, проходя между гранулами геля
- Молекулы средних размеров частично проникают в поры геля и движутся медленнее
- Мелкие молекулы свободно заходят в поры геля и движутся медленнее всего
Таким образом, компоненты смеси выходят из колонки в порядке убывания размеров молекул.
На эффективность гель-фильтрации влияют:
- Размер пор сорбента
- Однородность гранул по размеру
- Скорость потока элюента
- pH и ионная сила элюента
- Вязкость элюента
- Объем и концентрация наносимой пробы
3. Оборудование и материалы для гель-фильтрации
Гель-фильтрация проводится в хроматографических колонках из стекла или пластика диаметром 1-10 см. Высота слоя сорбента составляет 15-150 см. Для уплотнения геля на дне колонки помещают фильтр.
В качестве сорбента чаще всего используют гранулированные гели на основе декстрана с размером частиц 30-300 мкм. Их пористость может изменяться от 5 до 50 нм, а исключительный предел – от 1 до 2000 кДа.
Важный параметр геля - однородность гранул по размеру. Чем выше однородность, тем эффективнее разделение.
Для элюирования компонентов смеси применяют воду, разбавленные солевые или буферные растворы. Их состав подбирают с учетом свойств разделяемых веществ.
К вспомогательному оборудованию для гель-фильтрации относятся:
- Перистальтические насосы
- Сборники для фракций
- Детекторы для анализа фракций – спектрофотометры, рефрактометры и др.
- Фракционные коллекторы
При выборе оборудования следует учитывать тип разделяемых веществ, требуемую чистоту и выход продуктов.
4. Подготовка к эксперименту по гель-фильтрации
Для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательно подготовиться к эксперименту по гель-фильтрации.
Во-первых, следует подобрать оптимальные условия хроматографирования: тип и размер сорбента, pH и ионную силу элюента, скорость потока, объем пробы.
Затем готовят хроматографическую колонку: заливают подготовленный гель и уплотняют его при прокачке элюента. После заливки колонку кондиционируют в течение суток для полного набухания геля.
Перед нанесением образца его фильтруют и разводят в элюенте до оптимальной концентрации. Также готовят свежий раствор элюента.
Еще один важный этап – калибровка колонки с помощью маркерных веществ. Это позволяет определить рабочий диапазон и разрешающую способность метода.
5. Проведение гель-фильтрации
После подготовки колонки к работе можно приступать непосредственно к проведению гель-фильтрации.
Сначала аккуратно наносят образец на поверхность сорбента и запускают элюирование колонки буфером или водой. Скорость потока элюента должна быть постоянной на всем протяжении анализа.
При движении элюента компоненты образца последовательно выходят из колонки и собираются в отдельные фракции с помощью коллектора. Каждую фракцию анализируют для определения состава.
Для оценки эффективности разделения строят график зависимости концентрации компонента от номера фракции. Чем больше пиков не перекрывается, тем выше разрешение.
6. Повышение эффективности гель-фильтрации
Существует несколько способов повысить качество разделения веществ при гель-фильтрации:
- Уменьшение скорости потока элюента
- Увеличение высоты слоя сорбента
- Использование градиента концентрации элюента
- Применение колонок меньшего диаметра
Однако при этом увеличивается время анализа. Поэтому необходимо подбирать оптимальные условия.
7. Типичные ошибки при гель-фильтрации
Чтобы избежать ошибок, важно соблюдать правила проведения гель фильтрации на всех этапах:
- Тщательная дегазация элюента
- Медленное элюирование образца и непрерывный мониторинг буферного потока
- Постоянство скорости и состава элюента
- Избегание перегрузки колонки образцом
Несоблюдение этих правил приводит к снижению воспроизводимости результатов и размыванию пиков на хроматограмме.
8. Обработка результатов гель-фильтрации
Полученные данные анализа фракций обрабатывают с помощью специальных формул. Рассчитывают объем удерживания веществ, молекулярные массы, коэффициенты распределения. Результаты наносят на график в координатах «объем элюирования – концентрация».
Для установления взаимосвязи между объемом удерживания и молекулярной массой строят калибровочную кривую по веществам с известными молекулярными массами.
Таким образом, используя калибровочный график можно не только разделить смесь веществ, но и определить молекулярные характеристики ее компонентов.
9. Контроль правильности гель-фильтрации
Для подтверждения того, что принцип гель-фильтрации был реализован правильно, проводят контрольный анализ смеси белков с известными молекулярными массами. Например, смеси альбумина, овальбумина и рибонуклеазы.
Сравнивая экспериментально полученные объемы удерживания контрольных белков с литературными данными, делают вывод о правильной работе хроматографической системы.
10. Гель-фильтрация или гель-хроматография?
Часто термины гель-фильтрация и гель-хроматография употребляют как синонимы. Однако есть различия в их смысловом значении.
Гель-фильтрация шире и подразумевает использование геля в качестве молекулярного сита при любом способе разделения или очистке веществ.
Гель-хроматография – это разновидность хроматографии, где в качестве неподвижной фазы выступает именно гель, а разделение основано на принципе различия размеров молекул.
Таким образом, понятие гель-хроматография уже и является частным случаем более широкого термина гель-фильтрация.
11. Факторы, влияющие на скорость разделения
Скорость гель-фильтрации белков зависит от множества факторов:
- Размер пор сорбента
- Вязкость элюента
- Температура
- Скорость потока элюента
- Концентрация и объем наносимого образца
При прочих равных условиях, чем меньше размер пор геля и выше вязкость элюента, тем медленнее происходит разделение. Повышение температуры и скорости потока ускоряет процесс, но снижает эффективность.
12. Масштабирование процесса
Благодаря простой конструкции, гель-фильтрацию легко масштабировать от аналитических задач до препаративного выделения целевых веществ.
Для получения очищенных продуктов в миллиграммовых и граммовых количествах используют колонки большего диаметра (20-100 см) и объема сорбента (до 10 литров).
Производительность при этом возрастает, но несколько снижается разрешение. Поэтому требуется подбор оптимальных условий.
13. Автоматизация процесса
Современные хроматографические системы для гель-фильтрации оснащаются автоматическими модулями для управления потоками, сбора фракций и их анализа. Такие приборы позволяют получать воспроизводимые результаты и экономят время исследователя.
Однако высокая стоимость автоматических хроматографов ограничивает их использование, особенно на этапе отработки методики анализа.
14. Экономические аспекты метода
Несмотря на кажущуюся простоту, стоимость гель-фильтрации может быть довольно высокой. Основные расходные материалы – это сам гель и буферы или вода для элюирования. Кроме того, требуется дорогостоящее оборудование: хроматографические колонки, насосы, детекторы.
Тем не менее, затраты окупаются возможностью получения дорогостоящих очищенных препаратов, например, ферментов или вирусных антигенов для диагностики и лечения.