Для изучения и выявления вариантов в структуре ДНК применяется молекулярно-генетический метод. Для каждого участка ДНК, который исследуется, регион это хромосомы, ген или аллель, методы отличаются. В основе каждый молекулярно-генетический метод содержит те или иные манипуляции с РНК и ДНК. Все данные методы отличаются огромной сложностью, без лабораторных условий проводиться не могут, и персонал должен быть высококвалифицированный. Проводится эта работа в несколько этапов.
Этапы
Сначала образцы РНК или ДНК нужно получить. Здесь молекулярно-генетический метод может применяться по отношению к практически любому материалу: капля крови, лейкоциты, культура фибропластов, слизистая оболочка (соскоб), даже волосяные луковицы, - ДНК можно получить из любого образца. Она пригодна для того, чтобы применить любой молекулярно-генетический метод и различные их варианты, а уже выделенная ДНК долго хранится в заморозке. Второй этап посвящён накоплению нужных фрагментов (амплификации) ДНК, обеспечить же его помогает цепная полимеразная реакция in vitro (в пробирке, без участия живого организма). В результате выбранный фрагмент ДНК размножается с помощью этой цепной реакции, и количество ДНК возрастает буквально в миллион раз.
Третьим этапом молекулярно-генетических методов исследования предполагается рестрикция размноженных ДНК (это фрагментирование, разрывание или разрезание). Рестрикция проводится с помощью электрофореза на полиакриламидном или агарозном геле. Этот молекулярно-генетический метод изучения ДНК позволяет каждому фрагменту занять в геле определённое положение. После этого гель обрабатывается этидием бромида, способным связываться в ДНК, проводится облучение ультрафиолетом, после чего можно наблюдать участки свечения. Молекулярно-генетические методы диагностики разнообразны и многочисленны, однако первые два этапа характерны для всех. А вот для того, чтобы выявить фрагменты ДНК, гель можно окрашивать и многими другими существующими способами.
Разновидности
К самым прямым и распространённым способам обнаружения микобактерий можно отнести вышеописанный молекулярно-генетический метод изучения ДНК. Сущность его состоит в том, чтобы выявить в диагностическом материале специфические фрагменты цепочки ДНК-возбудителей. Молекулярно-генетические методы диагностики пока не имеют более эффективного способа распознавать такое заболевание, как туберкулёз. Применяя полимеразную цепную реакцию (ПЦР), можно быть уверенным, что исходная ДНК увеличит количество копий в миллион раз, то есть произойдёт амплификация, и это позволит визуализировать результаты. Уровень чувствительности здесь очень высок - более девяноста пяти процентов, что и является главным достоинством данного метода.
Остальные молекулярно-генетические методы исследования по эффективности уступают многократному копированию буквально вдвое, поскольку в этом случае редакционная проба показывает специфическую олигонуклеотидную последовательность возросшей в сто шесть раз. Даже культуральная диагностика туберкулёза органов дыхания значительно ниже по своей чувствительности. Именно поэтому современная медицина опирается на молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза. А описанный метод особо эффективен при встрече с возбудителями высокой антигенной изменчивости, определить которые другим способом гораздо более сложно - требуются особые питательные среды и длительное время культивирования. Биохимический и молекулярно-генетический методы дают совершенно разные по эффекту результаты.
Диагностика туберкулёза
Выстраивают ПЦР-диагностику туберкулёза наиболее часто с использованием тех последовательностей ДНК, которые специфичны для всех четырёх видов этого заболевания. Для достижения поставленной цели чаще всего используют праймеры, выявляющие последовательности IS элементов (IS-986, IS-6110), так как эти мигрирующие элементы характеризуют сугубо виды микобактерий туберкулёза и всегда присутствуют несколькими копиями в геноме. Также выделение ДНК можно осуществить из чистых культур и клинических (мокрота больных) любым другим приемлемым методом. Например, есть метод Boom, где используется лизирующий буфер на основе гуанидина, двуокиси кремния и тиоционата как носителя ДНК. Число больных, отличающихся скудным бактериовыделением, с каждым годом увеличивается, и потому в клинической практике утвердился совершенно другой уровень организации: молекулярно-генетический метод изучения ДНК играет уже главную роль в диагностике.
Однако нужно признать, что и он не без недостатков. Применение ПЦР-метода часто приносит огромное количество ложноположительных результатов, и виной здесь не только технические погрешности, но и особенности самого метода. Помимо всего прочего, с помощью данного способа диагностики определить степень жизнеспособности микобактерий, которые выявлены, просто невозможно. Но и этот недостаток не самый главный. Молекулярно-генетические методы ПЦР-диагностики влекут за собой опасность контаминации микобактериальных ДНК. Сертификационные требования по этой причине для ПЦР-лабораторий разработаны исключительно жёсткие, они требуют наличия трёх изолированных помещений. Технология ПЦР современная и очень сложная, её использование требует соответствующей аппаратуры и высококлассно подготовленного персонала.
Бактериоскопия
При установлении диагноза результаты ПЦР-исследования обязательно должны сопоставляться с остальными данными: клиническое обследование, рентгенография, микроскопия мазка, посев и даже ответ на специфическое лечение здесь очень важны. В этом ряду исследований ПЦР является только одним из компонентов. Обнаружить возбудитель в самом начале диагностики можно наиболее простыми и быстрыми методами - бактериологическими.
Здесь используется световой микроскоп (окраска по Цилю-Нильсену) и люминесцентный (окраска флюорохромами). Преимуществом бактериоскопии является быстрота получения результатов. А недостатком её справедливо считается ограниченность возможностей из-за низкой чувствительности. Однако именно этому методу отдана рекомендация ВОЗ как наиболее экономичного и основного для выявления больных туберкулёзом. Обнаружение микобактерий бактериологическим методом имеет значение прогноза, и оценивается бактериовыделение количественно. Гораздо увереннее с этим справляются молекулярно-генетические методы исследования туберкулеза.
Культуральные исследования
Лучшим выявлением микобактерий признают культуральные исследования. Посев патологического материала производится в яичные среды: Мордовского, Финна II, Левенштейна-Йенсена и тому подобные. Ориентировочным показателем развития устойчивости микобактерий к препаратам и косвенным свидетельством эффективности является количество микобактерий или их колоний в пробирке, если применён культуральный метод исследования. Чтобы повысить процент выделения микобактерий, посев патологического материала проводится на несколько сред.
Удовлетворяя многочисленные культуральные потребности, возбудителю в том числе предоставляют и жидкие среды. Используются при этом и автоматизированные системы учёта роста типа ВАНТЕС. Посевы должны провести в инкубации до семи-восьми недель. К этому времени посев с отсутствием роста можно считать отрицательным. Самым действенным способом выявления микобактерий туберкулёза считают биологические пробы: заражают диагностическим материалом морских свинок, которые к туберкулёзу чрезвычайно чувствительны.
Немного цифр
Интереснейшей областью исследования, которая открылась посредством ПЦР-диагностики, стало изучение M. tuberculosis - латентной инфекции. Современная концепция туберкулёзной инфекции говорит о том, что из ста человек, которые находились в контакте с M. tuberculosis, девяносто вполне могут инфицироваться, но только у десяти из них активная болезнь получает развитие. Остальные имеют противотуберкулёзный иммунитет, и потому в девяноста процентах случаев инфекция останется латентной. Обнаружить такую закономерность помог именно молекулярно-генетический метод.
Генетики утверждают, что пятьдесят пять процентов лиц, у которых посевы патологического материала были отрицательными, и восемьдесят процентов лиц, заражённых M. tuberculosis, но с протекающей без каких-либо рентгенографических проявлений болезнью, ответы ПЦР получили положительные. Именно генетический метод диагностики помог выявить больных из групп риска с помощью ПЦР-исследований, причём результаты их анализов (микроскопия и посевы) были отрицательными, а субклиническая инфекция M. tuberculosis присутствовала.
Современные исследования
Бактериологические лаборатории Российской Федерации используют и ускоренный метод абсолютных концентраций: тестируется нитратредуктазная активность микобактерий посредством реактива Грисса. Противотуберкулёзные центры пользуются методом, который позволяет определить лекарственную устойчивость. Это посев в жидкие среды, где автоматизирована радиометрическая и флюоресцентная система учёта роста микобактерий. Такой анализ делается быстро - до двух недель.
В настоящее время и новые методы разрабатываются: лекарственная устойчивость микобактерий оценивается на уровне генотипа. Изучение молекулярных механизмов резистентности показывает наличие генов и у микобактерий. Гены эти связаны с устойчивостью к определённым препаратам. Например, гены kasA, inhA, katG устойчивы к изониазиду, ген rpoB - к рифампицину, гены 16Sp РНК и rpsL - к стрептомицину, emb1 - к этамбутолу, gyrA - к фторхинолону и так далее.
Мутации
В современной диагностике значительно повысился молекулярно-генетический уровень метода изучения ДНК и позволил проводить широкомасштабные исследования мутаций во всём их спектре. Теперь мы знаем, что наиболее распространены мутации в 516, 526 и 531 кодонах гена rpoB, а также выявлены устойчивости к различным препаратам. Существует целый комплекс методов для типирования микобактерий с использованием не только методов традиционных - биохимических, биологических и культуральных, но широко применяются и современные молекулярно-генетические методы. Уже существуют адекватные и обеспечивающие верную диагностику методики обнаружения моногенных болезней. Они основываются на исследованиях ДНК в точном районе определённого гена. Это, как правило, процесс сложный, трудоёмкий и дорогостоящий, зато данные, которые предоставляют методы молекулярно-генетического анализа, значительно более точны и информативны, чем данные всех других анализов.
Давно известно, что ДНК не изменяется за всю жизнь организма, что она в любой ядерной клетке однакова, и это даёт возможность брать на анализ абсолютно любые клетки организма, на любых стадиях онтогенеза. Повреждённый ген можно обнаружить до появления первых симптомов, до развёрнутой клиники заболевания, а также у здоровых гетерозиготных людей, но имеющих в гене мутацию. Молекулярно-генетические методы диагностики наследственных болезней позволяют выявить её (прямым подходом ДНК-диагностики), а также проанализировать сегрегацию заболевания в семье с маркерными локусами ДНК (полиморфными участками), которые тесно сцеплены с повреждённым геном (то есть косвенным подходом ДНК-диагностики). Прямая или косвенная - любая ДНК-диагностика основывается на методах, идентифицирующих строго определённый участок ДНК человека.
Прямые методы
Прямыми методами ДНК-диагностики пользуются в случаях, когда ген-виновник наследственного заболевания известен, а также известны и типы его мутаций. Например, целесообразны прямые методы при целом ряде заболеваний. Это хорея Гентингтона (расширение CTG-повторов), фенилкетонурия (R408W), муковисцидоз (delF508, мажорная мутация) и тому подобные. Главным преимуществом прямого метода является стопроцентная точность диагностики, а также нет необходимости делать ДНК-анализ остальной семьи. Если мутация в соответствующем гене обнаружена, это позволяет совершенно точно утвердить диагноз наследственности, определить генотип для всей остальной отягощённой семьи.
Другим достоинством прямой диагностики считается выявление гетерозиготного носительства нехороших мутаций у родственников и родителей умершего от болезни. Это особенно актуально для заболеваний аутосомно-рецессивных. Недостатки у прямых методов тоже имеются. Чтобы их применить, нужно точно знать локализацию патологического гена, экзон-интронную его структуру и спектр его мутаций. Далеко не все моногенные болезни сегодня получили подобную информацию. Информативность прямых методов не может считаться полной, поскольку один и тот же ген может иметь большое количество патологических мутаций, что и обусловливает развитие наследственных болезней.
Косвенные методы
Косвенные методы в ДНК-диагностике применяются совсем в других случаях: если повреждённый ген не идентифицирован, а всего лишь локализован на хромосоме, или если прямая диагностика не дала результата (это бывает, если у гена сложная молекулярная организация или значительная протяжённость, если в нём много патологических мутаций). Косвенными методами проводится анализ сегрегации полиморфных маркеров в семье аллелей. Маркеры находятся в этом же хромосомном районе или тесно сцеплены с локусом заболевания и представляют собой делеции или инсерции, точковые замены, повторы, а их полиморфизм обусловлен разным количеством в блоке элементов.
Самыми удобными для косвенной диагностики считаются микросателлитные и минисателлитные полиморфные маркеры, которые широко распространены в геноме человека. Ценность их выражается в высокой информативности, если генетическое расстояние между повреждением в гене и маркером не оказывается слишком большим. В последнем случае точность оценки определяется в большой степени частотой рекомбинации между полиморфным маркером и повреждением. Косвенные методы диагностики также предусматривают обязательный предварительный этап исследования частоты аллелей анализируемых популяций среди носителей мутаций и больных, плюс к этому необходимость определения вероятности неравновесия и рекомбинации сцепления маркеров и мутантных аллелей гена.
Другие методы
Короткие сегменты РНК или ДНК, а также отдельный ген при микроскопическом исследовании визуализирован быть не может, поэтому, чтобы идентифицировать мутации, необходимы методы молекулярно-генетической диагностики. Существующий "Проект генома человека", как и другие достижения молекулярной генетики, во многом расширил возможность диагностики наследственных заболеваний - как пре-, так и постнатальной. Эти методы могут обеспечить раннее обнаружение и сделать прогноз поли- и моногенных болезней, у которых дебют происходит во взрослом возрасте. К сожалению, по техническим возможностям молекулярно-генетические исследования иногда выходят за этические рамки, которые установлены относительно наследственности, особенно когда диагностика проводится в подростковом и детском возрасте.
Структурные и количественные аномалии хромосом являются самыми распространёнными причинами и онкологических заболеваний, и многих пороков развития. Хромосомные аберрации необходимо идентифицировать, что важно для семейного консультирования - дать оценку прогноза наряду с репродуктивным риском при будущих беременностях. Хромосомный анализ является "золотым стандартом" генетической диагностики, но и у него возможности ограничены. Только методы молекулярно-генетического анализа могут сделать большее, потому что там применяются основанные технологиями клонирования флюоресцирующие метки, способны с их высокой чувствительностью выявить тонкие хромосомные изменения, которые невозможно обнаружить классическим цитогенетическим исследованием. Эти техники всё более расширяют наши диагностические возможности, когда обследуются дети с пороками развития, с умственной отсталостью, со многими другими наследственными заболеваниями.
Выводы
Очень важными для человечества явились знания структуры и функций генов, видов их изменчивости, умение распознавать наследственные болезни, что произошло в связи с развитием молекулярной генетики. Методы её направлены на исследование молекулы ДНК - и когда она находится в норме, и при повреждении её. Получение последовательностей нуклеотидов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) проходит поэтапно от получения образцов до идентификации отдельных фрагментов. Выделение геномной ДНК из клеток, рестрикция (разрывание), амплификация (клонирование), электрофорез фрагментов (разделение их по электрическому заряду и молекулярной массе с помощью агарозного геля). Идентификация определённых фрагментов, расположенных на его поверхности дискретной полосой.
Потом в дело вступают специальные фильтры, с помощью которых проходит гибридизация каждого фрагмента с клонированными фрагментами ДНК или с синтетическими радиоактивными зондами, являющимися контрольными, по которым и будет равняться каждый исследуемый фрагмент. Если изменилось положение или его длина сравнительно с зондом, если появился новый фрагмент или исчез, - всё это говорит о том, что исследуемый ген подвергся перестройке в последовательности нуклеотидов. Существует восемь основных методов молекулярно-генетического исследования: секвенирование (определение последовательности ДНК), полимеразная цепная реакция (увеличение числа последовательностей), получение праймеров известных генов, клонирование ДНК, получение рекомбинантных молекул, получение белков за счёт рекомбинантных молекул, создание полного набора (коллекции, библиотеки) клонированных фрагментов, которые получились с помощью рестрикции.
