Колориметрический метод – анализ, основанный на сравнении насыщенности окраски исследуемого и известного вещества. Результаты физико-химических тестов имеют большую ценность для многих отраслей науки, но больше всего исследование применяется в медицине.
Сущность колориметрического метода
Существует много видов анализов, при помощи которых определяют химический состав веществ. Какие-то из них универсальные и широко применяются в самых различных областях, другие – специфические, обладающие более высокой точностью. Колориметрический метод относится к универсальным.
Сущность анализа заключается в том, что насыщенность цвета раствора с неизвестной концентрацией сравнивается с окраской стандартного раствора. В процессе анализа в результате взаимодействия исследуемого компонента с определенным реагентом образуется окрашенное соединение. После завершения реакции полученный оттенок сравнивают с цветом растворов, концентрация которых уже известна.
Считается, что основоположник колориметрии – Роберт Бойль. Он использовал выжимку дубильных орешков, чтобы отличить в растворе железо от меди. Именно Бойль обратил внимание, что чем больше концентрация железа в растворе, тем насыщеннее тон последнего.
Колориметрия
Колориметрия – метод определения количества вещества в растворах. В основе анализа лежит закон Бугера-Ламберта-Бера: при попадании пучка света в плотный поглощающий слой вещества его интенсивность ослабевает.
Колориметрический метод определения концентрации вещества может использовать визуальное сравнение либо сравнение при помощи специальных приборов для измерения интенсивности цвета. Сравнение выполняется прямым и компенсационным способом.
- Прямой. Метод подразумевает сравнение уровня цвета исследуемого раствора при определенной плотности и температуре жидкости с эталонным раствором. При применении фотоколориметров и спектрофотометров в качестве эталонного раствора используют дистиллированную воду. Устройства измеряют силу тока, которая зависит от интенсивности света.
- Компенсационный. В основе метода лежит доведение окраски изучаемого образца до эталонной. Результат достигается путем добавления растворителя либо увеличением высоты слоя окрашиваемой среды.
Использование спектрофотометра, монохроматора и других точных приборов еще больше упрощает и без того несложный метод исследования и позволяет увеличить точность результатов. Эти приборы способны измерять величину пропускной способности света и определять длину волны.
Где применяется анализ
Колориметрический метод анализа применяется в том случае, когда известен точный химический состав, есть эталонный образец для сравнения, а температура исследуемого и эталонного образца одинаковая. Если необходимо быстро определить количество окрашенного вещества, но его так мало, что применить аналитический способ невозможно.
Колориметрия широко применяется в медицине при клинических биохимических исследованиях и в других областях:
- фармакологическая промышленность;
- пищевая и алкогольная промышленность;
- агрономия (определение качества почвы).
Достоинства и недостатки
Колориметрический метод, как и любой другой, имеет плюсы и минусы.
К достоинствам можно отнести следующее:
- простота проведения анализов, минимум подготовительных процедур;
- возможность проведения тестирования даже при маленьком количестве исследуемого материала;
- нет необходимости в дорогостоящем оборудовании, хотя последнее время все чаще применяются современные устройства, которые стоят недешево. Но обеспечивают максимально точный результат.
Недостатки: малая по сравнению с аналитическими методами точность анализа.
Биуретовый метод определения белка
Белок в сыворотке крови – показатель, отражающий состояние гомеостаза. Увеличение концентрации высокомолекулярного соединения в крови называется гиперпротеинемия, низкое содержание – гипопротеинемия.
Белки в сыворотке крови имеют разный состав, структуру, свойства, выполняют разные функции. Они делятся на ферменты, гормоны, иммуноглобулины и прочие. Для всех групп белков присущ ряд общих характеристик, на основе которых были разработаны методы определения высокомолекулярных органических соединений в биологических жидкостях.
Из всех способов в клинической биохимии наиболее часто применяются колориметрические методы определения белка. Они относительно дешевые, что важно для бюджетных организаций. и достаточно просты. Самый распространенный - биуретовый метод. Суть метода: белки в щелочной среде вступают в реакцию с сульфатом меди и образуют соединения фиолетового цвета. По насыщенности окрашивания определяют содержание белка в крови. Биоматериал для анализа берут утром натощак.
Анализ отличается высокой точностью, но есть факторы, которые влияют на концентрацию белка в крови:
- физическая активность незадолго до забора биоматериала;
- последние недели беременности и период кормления грудью;
- применение препаратов «Кортикотропин», «Мисклерон», «Клофибрат» способствует повышению содержания белка в крови, а использование «Пиразинамида» и эстрогена – к уменьшению концентрации;
- неправильное положение руки во время забора биоматериала.
Определение железа
Количество железа в крови – один из основных показателей при диагностике различных заболеваний. Вещество сконцентрировано в гемоглобине, обеспечивающем транспортировку кислорода в ткани. Для определения железа колориметрическим методом чаще всего в качестве основного реактива используется раствор батофенантролина (0,02%). Биоматериал – сыворотка без следов гемолиза.
Суть метода: при взаимодействии ионов двухвалентного железа и сульфатированого батофенантролина образуется окрашенный комплекс, насыщенность которого определяется фотометрически. Чтобы получить прозрачный раствор необходимо соблюдать правила забора биоматериала, но для точного определения оптических плотностей железо-лигандных комплексов высвобождают железо из гемоглобина при помощи гидроксиламина и детергентов (додецилсульфат натрия). По результату теста определяют наличие и степень патологии. В норме концентрация железа должна составлять:
- 14,2 – 26,0 мкмоль/л (мужчины);
- 10,6- 21,7 мкмоль/л (женщины).
Дефицит железа обычно связан с кровопотерями, недостаточном поступлении его с питанием или плохим всасыванием в ЖКТ.
Определение холестерина
Холестерин – органическое вещество, содержащееся в оболочке клеток многих организмов, включая человека. Он необходим для выработки холекальциферола и стероидных гормонов. Нормальным считается уровень холестерина 3,37-5,2 ммоль/л. Повышенное содержание – одна из основных причин развития атеросклероза.
Колориметрические методы определения холестерина позволяют распознать сосудистые заболевания на ранних этапах. По патологоанатомическим результатам при летальном исходе ишемии концентрация липофильного спирта у пациентов составляла 6,5-7,8 ммоль/л.
Принцип колориметрического метода в том, что холестерин окисляется 3бета-гидрокси-стероид оксидоредуктазой с высвобождением перекиси водорода, которая превращает р-аминоатипирин в окрашенное соединение. По насыщенности ее окраски определяют содержание холестерина.
При проведении теста у ребенка необходимо учитывать, что концентрация холестерина в детском возрасте не должна превышать 4,1 ммоль/л.
Что такое энзиматический колориметрический метод?
Ферментативные тесты основаны на использовании реакций ферментами с высокой активностью. Их широко применяют в аналитической химии для определения различных веществ - от ионов нитрата до макромолекул.
Ферментативные (энзиматические) методы отличаются специфичностью, позволяющей анализировать некоторые вещества в присутствии схожих по составу других веществ. Наиболее распространены методы, основанные на применении энзима – глюкозооксидазы. Тест используют для определения концентрации глюкозы в крови. Точность теста позволяет использовать его для корректировки дозировки гипогликемических средств у пациентов с сахарным диабетом второго типа.
Глюкозооксидантный метод считается одним из лучших количественных способов определения глюкозы. В качестве биоматериала может использоваться и кровь (капиллярная), и сыворотка, но плазма более предпочтительна, поскольку в ней понижено содержание гематокрита, который негативно влияет на точность результата.
В основном применяется кинетический метод фотометрирования. Его суть заключается в том, что при установленном соотношении глюкозооксидазы и пероксидазы, какое-то количество времени после начала реакции скорость образования окрашенного соединения будет соразмерна уровню глюкозы в пробе. Основное преимущество теста – на результат не влияет наличие в пробе сторонних соединений. Есть у метода и недостаток – для проведения теста необходимы дорогостоящие измерительные приборы от немецких или шведских производителей.
Заключение
Колориметрический метод отличается точностью и простотой применения. Его использование в медицине позволяет на ранних стадиях выявить различные патологические изменения в организме. С внедрением новых технологий метод совершенствуется и становится все более востребованным.
