Выделение ДНК - подготовка образцов. Способы получения ДНК
ДНК является уникальной молекулой, несущей в себе генетический код всех живых организмов. Изучение ее структуры и свойств позволило не только понять процессы, происходящие в клетках, но и использовать ДНК в качестве инструмента в таких областях, как биотехнология, медицина и криминалистика. В данной статье мы подробно рассмотрим современные методы выделения ДНК из биологических образцов.
История открытия и изучения ДНК
ДНК была открыта в 1869 году швейцарским ученым Фридрихом Мишером. Он выделил неизвестное вещество из гноя и назвал его «нуклеин». Только спустя много лет стало понятно, что это была ДНК.
Важнейшим этапом в исследовании ДНК стало открытие ее структуры учеными Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком в 1953 году. Они показали, что молекула ДНК имеет форму двойной спирали, состоящей из двух комплементарных цепочек нуклеотидов, соединенных водородными связями. Это открытие положило начало бурному развитию молекулярной биологии и генетики.
Подготовка биоматериала для выделения ДНК
Для исследований ДНК ее необходимо предварительно выделить из клеток организма. В качестве биологического материала могут использоваться:
- Кровь
- Соскобы слизистых оболочек (например, со слизистой рта)
- Выделения (моча, слюна)
- Волосы и ногти
- Костный мозг
- Плацента
Образцы должны отбираться в стерильных условиях во избежание загрязнения. Оптимально начинать выделение ДНК сразу после взятия материала, а если это невозможно, его необходимо поместить в стерильную емкость и хранить в замороженном состоянии.
| 1869 | Открытие ДНК Фридрихом Мишером |
| 1953 | Установление структуры ДНК Уотсоном и Криком |
Выделенная ДНК чувствительна к действию ферментов (ДНКаз и РНКаз), поэтому важно проводить процедуру в условиях, препятствующих активности этих ферментов.
Основные методы выделения ДНК
Существует несколько основных методов, позволяющих выделить ДНК из клеток:
- Фенол-хлороформная экстракция
- Сорбция на твердых носителях
- Осаждение этанолом или изопропанолом
Рассмотрим их подробнее.
Фенол-хлороформная экстракция
Этот метод основан на способности фенола разрушать клеточные мембраны и высвобождать содержимое клеток. При добавлении хлороформа и центрифугировании образуется двухфазная система, в которой ДНК концентрируется в водной фазе. Затем ДНК осаждают этанолом.
Достоинствами метода являются высокий выход ДНК и простота. К недостаткам относится токсичность используемых реагентов.
Сорбция на твердых носителях
Этот метод основан на способности различных твердых веществ связывать молекулы ДНК. В качестве сорбентов часто используют силикагель, стеклянные частички, ионообменные смолы.
Процесс сорбции ДНК включает несколько этапов:
- Лизис клеток и получение суспензии с ДНК
- Контакт суспензии с сорбентом и связывание ДНК
- Отмывка сорбента от посторонних примесей
- Элюирование (вымывание) ДНК с сорбента
К преимуществам данного метода относят высокую чистоту получаемой ДНК и относительную простоту процедуры. Недостатком являются затраты на сорбент.
Осаждение этанолом или изопропанолом
В основе этого метода лежит способность солей и органических растворителей, таких как этанол и изопропанол, осаждать нитевидные макромолекулы ДНК из раствора.
После воздействия на клетки лизирующих агентов к гомогенату добавляют определенную концентрацию соли и органический растворитель. ДНК осаждается и затем отделяется центрифугированием.
Достоинства метода — простота и низкая стоимость. К недостаткам относится возможное загрязнение ДНК растворителем.
Коммерческие наборы для выделения ДНК
На рынке представлено множество готовых наборов для выделения ДНК из различных образцов. Они содержат все необходимые реагенты и сорбенты для проведения процедуры.
Преимущества коммерческих систем:
- Простота и удобство использования
- Стандартизация процесса
- Высокая чистота выделенной ДНК
К недостаткам относится высокая стоимость наборов.
Контроль качества выделенной ДНК
Для успешного проведения дальнейших исследований важно убедиться в том, что выделенная ДНК имеет достаточную чистоту и не содержит примесей, ингибирующих последующие реакции, например, таблица генетического кода.
Для контроля качества выделенной ДНК используют такие методы, как:
- Спектрофотометрия
- ПЦР с универсальными праймерами
- Электрофорез в агарозном геле
Очень чувствительный метод контроля — ПЦР. Наличие продуктов амплификации свидетельствует об отсутствии ингибиторов.
Обработка биологического материала перед выделением ДНК
Для получения высококачественной ДНК немаловажно грамотно провести обработку биоматериала перед выделением. Необходимо:
- Соблюдать правила асептики при отборе образцов
- Использовать свежие или правильно замороженные образцы
- Применять одноразовую посуду и расходные материалы
Это позволит минимизировать риск контаминации образцов ДНК посторонней микрофлорой и веществами-ингибиторами реакций амплификации.
Перспективные методы выделения ДНК
Несмотря на наличие отработанных подходов, ведутся активные разработки новых технологий, обладающих преимуществами по сравнению с существующими.
К перспективным методам выделения ДНК можно отнести:
- Микрофлюидные чипы для автоматизации процесса
- Использование магнитных наночастиц в качестве сорбентов
- Применение ДНК-связывающих белков
Внедрение подобных методов позволит ускорить получение ДНК и улучшить ее качество.
Автоматизация процесса выделения ДНК
Ручное выделение ДНК требует больших временных затрат и внимания к деталям процедуры. Поэтому в последние годы все большее распространение получают автоматизированные системы.
Автоматические станции для выделения ДНК обладают следующими преимуществами:
- Высокая скорость обработки образцов
- Стандартизация и воспроизводимость процесса
- Уменьшение влияния человеческого фактора
- Возможность одновременной обработки большого количества проб
Автоматизированные комплексы широко применяются в крупных лабораториях для высокопроизводительного выделения ДНК.
Выбор метода выделения ДНК под конкретные задачи
Правильный подбор метода выделения ДНК важен для получения препарата, пригодного для последующего анализа. Необходимо учитывать:
- Тип исходного биоматериала
- Необходимый выход ДНК
- Требуемую чистоту выделенной ДНК
- Стоимость и длительность процесса
Для рутинных задач хорошо подходят недорогие коммерческие наборы. В сложных случаях может потребоваться ручное выделение ДНК с использованием различных методов.
Типичные проблемы при выделении ДНК
Несмотря на кажущуюся простоту процедуры, на практике возможно возникновение следующих проблем:
- Низкий выход или полное отсутствие ДНК
- Загрязнение образцов посторонней ДНК
- Плохое качество выделенной ДНК, наличие ингибиторов
Для решения этих проблем важно строго соблюдать протокол выделения ДНК, учитывать специфику образца, проводить тщательную дезактивацию нуклеаз.
Хранение выделенной ДНК
Надлежащие условия хранения критически важны для сохранности выделенного препарата ДНК. Рекомендуется:
- Хранить растворы ДНК при температуре -20°C в течение нескольких лет
- Избегать частых циклов заморозки-оттаивания
- Использовать буферы, стабилизирующие структуру ДНК
Правильное хранение гарантирует, что выделенная ДНК сохранит свои свойства и пригодность для анализа.