Хроматография – это один из методов разделения веществ. Она используется для последующего качественного и количественного анализа физических и химических свойств микрочастиц. Разновидностью данной технологии является аффинная хроматография. Идея дифференциации белковых соединений с использованием свойства сродства молекул известна в науке уже несколько десятилетий. Однако свое развитие она получила только в последние годы, после того, как были внедрены высокопористые гидрофильные материалы, использующиеся в качестве матрицы. Данный метод позволяет решать как аналитические задачи (разделение веществ и их идентификация), так и препаративные (очистка, концентрирование).
Сущность
Аффинная хроматография (от латинского слова affinis – «смежный», «родственный») основана на аффинных взаимодействиях, которые представляют собой образование высоко специфических связей между молекулой-разделителем (лигандом или аффинантом) и целевой молекулой. Эти механизмы широко распространены в природе (связь медиаторов или гормонов и рецепторов, антител и антигенов, гибридизация полинуклеотидов и другие виды процессов). В медицине аффинная хроматография начала применяться в практических целях начиная с 1951 г.
Разделение компонентов происходит следующим образом:
- рабочий раствор, содержащий вещество, которое необходимо выделить, пропускают через сорбент;
- лиганд, нанесенный на матрицу-сорбент, удерживает это вещество;
- происходит его концентрирование (накопление);
- извлечение выделенного вещества с сорбента при помощи вымывания растворителем.
Данный способ позволяет выделить целые клетки. Отличием от традиционной сорбционной хроматографии является то, что существует прочное биоспецифическое связывание выделяемого компонента с сорбентом, характеризующееся высокой избирательностью.
Адсорбенты
В качестве адсорбентов применяют следующие вещества:
- Гелеобразные составы на основе агарозы – полисахарида, получаемого из агара. Наиболее часто используют 3 разновидности: сефарозу 4 В, CL (сшитая агароза) и аффи-гель. Последний состав представляет собой модифицированный гель из агарозы и полиакриламида. Он обладает большей биологической инертностью, высокой химической и термической стойкостью.
- Кремнезем (силикагель).
- Стекло.
- Органические полимеры.
Для устранения механических препятствий при контакте лиганда применяют дополнительные вещества, отделяющие его от носителя (пептиды, диамины, полиамины, олигосахариды).
Аппаратура
Оборудование для аффинной хроматографии включает в свой состав следующие основные узлы:
- емкости-накопители для подвижной фазы (элюента);
- насосы высокого давления для подачи среды (чаще всего поршневые);
- фильтр для очистки элюентов от пыли;
- дозирующее устройство;
- хроматографическая колонна для разделения смеси;
- детектор для определения разделенных компонентов, выходящих из колонны;
- регистраторы хроматограмм и микропроцессорный блок (ЭВМ).
С целью уменьшения количества растворенного воздуха через подвижную фазу предварительно пропускают гелий. Для изменения концентрации элюента устанавливают несколько насосов, управляемых программатором. Хроматографические колонны изготавливаются из нержавеющей стали (при повышенных требованиях к коррозионной устойчивости), из стекла (универсальный вариант) или из акрила. Для препаративных целей их диаметр может колебаться от 2 до 70 см. В аналитической хроматографии применяют микроколонки Ø10-150 мкм.
Для повышения чувствительности детекторов в смесь вводятся реагенты, которые способствуют образованию веществ, которые больше поглощают лучи в ультрафиолетовой или видимой области спектра.
Методика проведения
Различают 2 основных вида жидкостной аффинной хроматографии:
- Колоночная, при которой колонну заполняют неподвижной фазой и через нее пропускают смесь с потоком элюента. Разделение может происходить под давлением или под в результате действия силы тяжести.
- Тонкослойная. Элюент движется по плоскому слою адсорбента под воздействием капиллярных сил. Адсорбент наносят на пластину из стекла, керамическую или кварцевую палочку, металлическую фольгу.
Основные этапы работ включают в себя:
- подготовка адсорбента, фиксация лиганда на носителе;
- подача смеси для разделения в хроматографическую колонну;
- загрузка подвижной фазы, связывание компонента лигандом;
- замена фазы для выделения связанного вещества.
Назначение
Аффинная хроматография используется для выделения следующих видов веществ (в скобках указан вид применяемого при этом лиганда):
- аналоги ферментативных ингибиторов, субстратов и кофакторов (ферменты);
- биоорганические вещества, обладающие признаками генетической чужеродности, вирусы и клетки (антитела);
- высокомолекулярные углеводы, полимеры моносахаридов, гликопротеины (лектины);
- ядерные белки, нуклеотидилтрансферазы (нуклеиновые кислоты);
- рецепторы, транспортные белки (витамины, гормоны);
- белки, взаимодействующие с клеточными мембранами (клетки).
Эта технология также используется для получения иммобилизованных ферментов, а привязка их к целлюлозе позволяет изготовить иммуносорбенты.
Хроматография ДНК-связывающих белков
Выделение ДНК-связывающих белков производится с помощью гепарина. Этот гликозаминогликан способен связывать большой диапазон молекул. Аффинная хроматография белков данной группы используется для выделения таких веществ, как:
- факторы инициации и элонгации трансляции (синтез молекул нуклеиновых кислот и белков);
- рестриктазы (ферменты, узнающие определенные последовательности в двухцепочечной ДНК);
- ДНК-лигазы и полимеразы (ферменты, катализирующие соединение двух молекул с образованием новой химической связи и участвующие в репликации ДНК);
- ингибиторы сериновых протеаз, которые играют важную роль в иммунных и воспалительных процессах;
- факторы роста: фибробластов, Шванна, эндотелиальный;
- белки межклеточного матрикса;
- рецепторы гормонов;
- липопротеиды.
Достоинства
Данный метод является одним из самых специфических для выделения реакционноспособных соединений (ферментов и более крупных агрегатов – вирусов). Однако он используется не только для выделения биологически активных веществ.
Выявление антител в малых количествах, количественная оценка полиадениловой кислоты, экспресс-определение молекулярных масс дегидрогеназ, удаление определенных загрязнителей, изучение кинетики активации неактивной формы трипсина, молекулярного строения интерферонов человека – вот далеко не весь перечень исследований, при которых применяется аффинная хроматография. Применение в клинике обусловлено такими ее преимуществами, как:
- Возможность эффективной очистки белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот. Они незначительно отличаются по своим физико-химическим свойствам и теряют активность при гидролизе, денатурации и прочих видах воздействия, используемых в других методах.
- Быстрота разделения веществ, динамический характер процесса.
- Отсутствие необходимости в специальной очистке ферментов и гомогенизации изоферментов для определения констант диссоциации.
- Возможность разделения широкого круга веществ.
- Небольшой расход лигандов.
- Возможность разделения веществ в больших объемах.
- Обратимый процесс связывания биологических макромолекул.
Данную методику можно совмещать с другими, накладывать дополнительное поле (гравитационное, электромагнитное). Это позволяет расширить технические возможности хроматографии.
Ферментная инженерия
Благодаря этому методу началось активное развитие новой отрасли биотехнологий – ферментной инженерии.
Аффинная хроматография применительно к выделению ферментов обладает следующими преимуществами:
- получение ферментов в больших количествах в результате меньших затрат времени, как результат – их удешевление;
- иммобилизация ферментов позволяет значительно расширить область их применения в медицине и промышленности;
- связь ферментов с нерастворимой твердой подложкой дает возможность изучить влияние микроокружения и направление реакций, которые играют важную роль в природных и физиологических процессах.
