Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.
Сущность
Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.
В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).
История развития
Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.
В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.
К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.
Типы исследуемого материала
Различают 2 основных вида культур тканей растений:
- Получаемые без разрушения и сохраняющие характерные особенности, присущие живому организму.
- Извлекаемые в результате расщепления (химического, ферментативного или механического) из первичной ткани. Могут формироваться из одной или нескольких клеточных культур.
По способу выращивания выделяют следующие методы:
- на «кормящем слое», при котором вещество, стимулирующее рост тканей, выделяют делящиеся клетки того же вида растений;
- с использованием ткани-«няньки», которая находится рядом с культивируемыми клетками;
- применение питательной среды от обособленной делящейся клеточной группы;
- выращивание отдельных единичных клеток в микрокапле, насыщенной по составу.
Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.
Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.
Необходимые условия
Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:
- Соблюдение стерильности. Для проведения пересадок применяются специальные боксы с подачей очищенного воздуха, оснащенные ультрафиолетовыми лампами. Асептической обработке должны подвергаться инструменты и материалы, одежда и руки персонала.
- Использование специально подобранных питательных сред, содержащих источники углерода и энергии (обычно сахароза и глюкоза), микро- и макроэлементы, регуляторы роста (ауксины, цитокинины), витамины (тиамин, рибофлавин, аскорбиновая и пантотеновая кислота и другие).
- Соблюдение температурного (18-30° С), светового режима и влажности (60-70 %). Большинство каллусных культур тканей выращивают при рассеянном свете, так как они не содержат хлоропластов, но для некоторых растений требуется подсветка.
В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).
Достоинства и недостатки
Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:
- хорошая воспроизводимость полученных результатов;
- регулирование межклеточных взаимодействий;
- небольшой расход реагентов;
- генетическая однородность клеточных линий;
- возможность механизации процесса выращивания;
- контроль над условиями содержания клеток;
- низкотемпературное хранение живых культур.
К недостатком данной биотехнологии относят:
- необходимость соблюдения строгих условий асептики;
- нестабильность свойств клеток и возможность их нежелательного смешения;
- дороговизна химических реагентов;
- неполная равноценность культивируемых тканей и клеток в живом организме.
Применение
Метод культуры тканей используется для проведения исследований:
- процессов внутри клеток (синтез ДНК, РНК и белков, обмен веществ и влияние на него с помощью лекарственных препаратов);
- межклеточных реакций (прохождение веществ через клеточные мембраны, работа комплекса гормон-рецептор, способность клеток слипаться друг с другом, формирование гистологических структур);
- взаимодействия с окружающей средой (поглощение питательных веществ, заражение инфекциями, процессы зарождения и развития опухолей и другие);
- результатов генетических манипуляций с клетками.
Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:
- получение эффективных гербицидов, регуляторов роста для агрономических культур, биологически активных соединений для применения в производстве лекарственных препаратов (алкалоиды, стероиды и другие);
- направленный мутагенез, выведение новых гибридов, преодоление постгамной несовместимости;
- клональное размножение, которое позволяет получить большое количество генетически идентичных растений;
- выведение вирусоустойчивых и безвирусных растений;
- криоконсервация генофонда;
- реконструкция тканей, создание источников стволовых клеток (тканевая инженерия).
