В дифференциальном определении энтеробактерий и некоторых вибрионов особое место занимает реакция Фогеса-Проскауэра. Тест основан на способности бактерий ферментировать глюкозу с образованием ацетоина.
Сущность процесса исследования
В микробиологии реакция Фогеса-Проскауэра часто применяется для дифференциации внутри семейства энтеробактерий иерсиний (в том числе и возбудителей псевдотуберкулеза и энтероколитов), кишечных палочек, спорообразующих аэробов. Результат визуализируется за счет цветового окрашивания среды при добавлении определенных реагентов.
Данный тест относится к серии IMViC (аббревиатура Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - группе идентификационных тестов, включающих дифференциальные определения:
- с индолом, основанным на расщеплении триптофана в индол, используется в присутствии реагента Ковача либо Эрлиха;
- с применением метилрота, или метилового красного, обнаруживающего заданный pH в результате метаболизирования глюкозы;
- реакции Фогеса-Проскауэра на обнаружение ацетил-метилкарбинола;
- утилизации цитрата с изменением цвета в результате ощелачивания среды.
Сущность процесса - визуализация присутствия диагностируемых бактерий за счет взаимодействия ацетоина, образуемого ими, с едким кали в присутствии кислорода. Происходит окисление ацетил-метилкарбинола до диацетила, который образует соединение ярко-красного или розового цвета. Повышают чувствительность теста введением альфа-нафтола до внесения едкого кали.
Постановка теста
Постановка реакции Фогеса-Проскауэра предполагает предварительное культивирование микроорганизмов. Чистая культура высевается на дифференциально-диагностическую среду Кларка, вариация которой - бульон Кларка (без добавления агар-агара). Используется либо готовая среда, либо приготовленная самостоятельно. Состав включает:
- 5 г пептона;
- 5 г глюкозы;
- 5 г двухосновного фосфата калия;
- 1 л дистиллята.
В ходе исследования производится посев культуры стерильной бактериологической петлей в жидкую среду. Количество - 5 мл в пробирке плюс контроль. Инкубация осуществляется при температуре 35-37 градусов в течение двух суток. Далее поэтапно производят исследование реакции Фогеса-Проскауэра:
- 2,5 мл культуры на бульоне переносят в стерильную пробирку.
- Вносят шесть капель альфа-нафтола (5%-ный спиртовой раствор).
- Прибавляют 40%-ный раствор едкого кали в количестве 0,1 мл, или две капли.
- Перемешивание осуществляют осторожным встряхиванием пробирки.
- Оценивают результат по прошествии 15 минут от начала эксперимента.
Альтернативный метод проведения теста - ночная инкубация, время которой сокращают до 18 часов либо до суток. Помимо такого метода применяют также экспресс-тест: вносят петлей в 2 мл среды культуру, инкубируют около четырех часов, далее добавляют реагенты в равном количестве 2-3 капель, перемешивают и оценивают итог через десять минут.
Контролем выступает один из возбудителей пневмонии Klebsiella pneumoniae - штамм atcc 13883.
Оценка результата
По истечении необходимого времени после добавления реактивов (от 5 до 15 минут) должна наблюдаться вишнево-красная окраска при ярко выраженной положительной реакции, красная и розовая - при слабой положительной. Отсутствие изменений регистрируют как отрицательный результат.
Избыток едкого кали в растворе может давать имитацию позитивной реакции, окрашивая в медный цвет. В этом случае следует фиксировать негативный ответ тестируемой колонии. Также медное окрашивание появляется в случаях, когда оценка дается спустя час после введения реагентов.
При оценке результата необходимо учитывать, что длительное культивирование исследуемых микроорганизмов (свыше трех суток) ведет к закислению среды, что может привести к некорректному исходу исследования. Реакция может быть слабо выраженной положительной либо ложноотрицательной.
Требования к реагентам для теста
Реагенты для проведения реакции Фогеса-Проскауэра должны соответствовать требованиям, таким, как правильная концентрация, высокая степень очистки и стабильность, которая достигается посредством соблюдения правил хранения.
Готовые наборы для теста содержат, как правило, реагенты на 100 и более применений и находятся в пластиковых или затемненных стеклянных флаконах. Качество регулируется соответствующей документацией.
