Молекулярно-биологические методы исследования играют большую роль в современной медицине, криминалистике и биологии. Благодаря достижениям в области изучения ДНК и РНК, человек способен изучить геном организма, определить возбудителя заболевания, распознать нужную нуклеиновую кислоту в смеси кислот и т.д.
Молекулярно-биологические методы исследования. Что это такое?
Еще в 70-80-х годах ученым впервые удалось расшифровать геном человека. Это событие дало толчок развитию генной инженерии и молекулярной биологии. Изучение свойств ДНК и РНК привело к тому, что теперь можно использовать эти нуклеиновые кислоты в целях диагностики заболевания, изучения генов.
Получение ДНК и РНК
Молекулярно-биологические методы диагностики требуют наличия исходного материала: чаще это нуклеиновые кислоты. Существует несколько способов выделения этих веществ из клеток живых организмов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки, и это надо учитывать при выборе метода выделения нуклеиновых кислот в чистом виде.
1. Получение ДНК по Мармуру. Метод заключается в обработке смеси веществ спиртом, в результате чего чистая ДНК выпадает в осадок. Минусом этого способа является использование агрессивных веществ: фенола и хлороформа.
2. Выделение ДНК по Буму. Основное вещество, которое используется здесь, – это гуанидин тиоционат (GuSCN). Оно способствует осаждению дезоксирибонуклеиновой кислоты на специализированных субстратах, с которых в последующем можно ее собрать с помощью специального буфера. Однако GuSCN – это ингибитор ПТЦ, и даже небольшая его часть, попавшая в осажденную ДНК, может повлиять на ход полимеразной цепной реакции, которая играет важную роль при работе с нуклеиновыми кислотами.
3. Осаждение примесей. Метод отличается от предыдущих тем, что осаждаются не сами молекулы дехоксирибонуклеиновой кислоты, а примеси. Чтобы это осуществить, используют ионообменники. Недостаток в том, что не все вещества могут осадиться.
4. Массовый скрининг. Используется этот способ в тех случаях, когда не нужны точные сведения о составе молекулы ДНК, а необходимо получить какие-то статистические данные. Объясняется это тем, что структура нуклеиновой кислоты может повредиться при обработке детергентами, в частности, щелочами.
Классификация методов исследования
Все молекулярно-биологические методы исследования делятся на три большие группы:
1. Амплификационные (с использованием множества ферментов). Сюда относится ПЦР – полимеразная цепная реакция, которая играет большую роль во многих из методов диагностики.
2. Неамплификационные. Эта группа методов связана непосредственно с работой смесей нуклеиновых кислот. Примерами являются 3 вида блоттингов, in situ гибридизация и т.д.
3. Методы, основанные на распознавании сигнала от молекулы зонда, который связывается с определенной ДНК или РНК зонда. Пример - система гибридизации в растворе Hybride Capture System (hc2).
Ферменты, которые могут использоваться в молекулярно-биологических методах исследования
Многие методы молекулярной диагностики подразумевают использование обширного диапазона ферментов. Ниже представлены применяемые наиболее часто:
1. Рестриктаза – «режет» молекулу ДНК на необходимые части.
2. ДНК-полимераза – синтезирует двухцепочечную молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты.
3. Обратная транскриптаза (ревертаза) – используется для синтеза ДНК на матрице РНК.
4. ДНК-лигаза – отвечает за образование фосфодиэфирных связей между нуклеотидами.
5. Экзонуклеаза – удаляет нуклеотиды с концевых участков молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты.
ПЦР – основной способ амплификации ДНК
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) активно используется в современной молекулярной биологии. Это метод, при котором из одной молекулы ДНК можно получить огромное количество копий (амплифицировать молекулы).
Основные функции ПЦР:
- диагностика заболеваний;
- клонирование участков ДНК, генов.
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимы следующие элементы: исходная молекула ДНК, термостабильная ДНК-полимераза (Taq или Pfu), дезоксирибонуклеотид-фосфаты (источники азотистых оснований), праймеры (2 праймера на 1 молекулу ДНК) и сама буферная система, в которой возможно проведение всех реакций.
ПЦР состоит из трех этапов: денатурация, отжиг праймеров и элонгация.
1. Денатурация. При температуре 94-95 градусов по Цельсию просходит разрыв водородных связей между двумя цепями ДНК, и в итоге мы получаем две одноцепочечные молекулы.
2. Отжиг праймеров. При температуре 50-60 градусов по Цельсию происходит присоединение праймеров на концах одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты по типу комплиментарности.
3. Элонгация. При температуре 72 градусов происходит синтез дочерних двухцепочечных молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты.
Секвенирование ДНК
Молекулярно-биологические методы исследования часто требуют знания последовательности нуклеотидов в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты. Для определения генетического кода проводится секвенирование. Молекулярная диагностика будущего будет основана на знаниях, полученных при определении последовательности человека.
Выделяют следующие виды секвенирования:
- секвенирование по Максаму-Гилберту;
- секвенирование по Сэнгеру;
- пиросеквенирование;
- нанопоровое секвенирование.
