Иммобилизованные ферменты и их применение

Впервые понятие об иммобилизованных ферментах возникло во второй половине 20-го века. Между тем, еще в 1916 г. было установлено, что сорбированная на угле сахароза сохраняла каталитическую активность. В 1953 г. Д. Шлейт и Н. Грубхофер осуществили первые связывания пепсина, амилазы, карбоксипептидазы и РНКазы с нерастворимым носителем. Понятие иммобилизованных ферментов было узаконено в 1971 г. Это случилось на первой конференции по вопросам инженерной энзимологии. В настоящее же время понятие об иммобилизованных ферментах рассматривается в более широком смысле, чем это было в конце 20 века. Рассмотрим эту категорию подробнее.

Общие сведения

Иммобилизованные ферменты – соединения, которые искусственно связываются с нерастворимым носителем. При этом они сохраняют свои каталитические свойства. В настоящее время этот процесс рассматривается в двух аспектах – в рамках частичной и полной ограниченности свободы перемещения белковых молекул.

Достоинства

Ученые установили определенные преимущества иммобилизованных ферментов. Выступая в качестве гетерогенных катализаторов, они могут с легкостью отделяться от реакционной среды. В рамках исследований установлено, что применение иммобилизованных ферментов может быть многократным. В процессе связывания соединения изменяют свои свойства. Они приобретают субстратную специфичность, устойчивость. При этом их активность начинает зависеть от условий среды. Иммобилизованные ферменты отличаются долговечностью и высокой степенью стабильности. Она больше, чем, например, у свободных энзимов в тысячи, десятки тысяч раз. Все это обеспечивает высокую эффективность, конкурентоспособность и экономичность технологий, в которых присутствуют иммобилизованные ферменты.

Носители

Дж. Порату определил ключевые свойства идеальных материалов, которые должны использоваться при иммобилизации. Носители должны обладать:

1. Нерастворимостью.
2. Высокой биологической и химической устойчивостью.
3. Способностью к быстрой активации. Носители должны легко переходить в реакционно-способный вид.
4. Значительной гидрофильностью.
5. Необходимой проницаемостью. Ее показатель должен быть одинаково приемлем и для ферментов, и для коферментов, продуктов реакции и субстратов.
   

В настоящее время не существует материала, который бы полностью соответствовал этим требованиям. Тем не менее на практике применяются носители, которые пригодны к иммобилизации определенной категории ферментов в конкретных условиях.

Классификация

В зависимости от своей природы материалы, при связи с которыми соединения превращаются в иммобилизованные ферменты, разделяются на неорганические и органические. Связывание многих соединений осуществляется с полимерными носителями. Эти органические материалы разделяют на 2 класса: синтетические и природные. В каждом из них, в свою очередь, выделяют группы в зависимости от строения. Неорганические носители представлены преимущественно материалами из стекла, керамики, глины, силикагеля, графитовой сажи. При работе с материалами популярны методы сухой химии. Иммобилизованные ферменты получают путем покрытия носителей пленкой оксидов титана, алюминия, циркония, гафния или обработки органическими полимерами. Важным достоинством материалов является легкость регенерации.

Белковые носители

Наибольшей популярностью пользуются липидные, полисахаридные и белковые материалы. Среди последних стоит выделить структурные полимеры. К ним в первую очередь относят коллаген, фибрин, кератин, а также желатин. Такие белки достаточно широко распространены в природной среде. Они доступны и экономичны. Кроме этого, они обладают большим количеством функциональных групп для связывания. Белки отличаются способностью к биодеградации. Это позволяет расширить применение иммобилизованных ферментов в медицине. Между тем, есть у белков и отрицательные свойства. Недостатки использования иммобилизованных ферментов на протеиновых носителях заключаются в высокой иммуногенности последних, а также возможность внедрять в реакции только определенные их группы.

Полисахариды, аминосахариды

Из этих материалов чаще всего применяются хитин, декстран, целлюлоза, агароза и их производные. Чтобы полисахариды были более устойчивы к реакциям, их линейные цепи сшивают поперечно эпихлоргидрином. В сетчатые структуры достаточно свободно вводятся разные ионогенные группировки. Хитин в больших количествах скапливается в виде отходов при промышленной переработке креветок и крабов. Это вещество отличается химической стойкостью и обладает хорошо выраженной пористой структурой.

Синтетические полимеры

Эта группа материалов отличается большим разнообразием и доступностью. В нее включены полимеры на основе акриловой кислоты, стирола, поливинилового спирта, полиуретановые и полиамидные полимеры. Большинство из них отличаются механической прочностью. В процессе преобразования они обеспечивают возможность варьирования размера пор в достаточно широких пределах, введения разнообразных функциональных групп.

Способы связывания

В настоящее время существует два принципиально отличных друг от друга варианта иммобилизации. Первым является получение соединений без ковалентных связей с носителем. Этот способ является физическим. Другой вариант предполагает возникновение ковалентной связи с материалом. Это химический метод.

Адсорбция

С помощью нее иммобилизованные ферменты получают путем удерживания препарата на поверхности носителя благодаря дисперсионным, гидрофобным, электростатическим взаимодействиям и водородным связям. Адсорбция стала первым способом ограничения подвижности элементов. Однако и в настоящее время этот вариант не потерял своей актуальности. Более того, адсорбция считается наиболее распространенным способом иммобилизации в промышленности.

Особенности способа

В научных изданиях описано более 70 ферментов, полученных адсорбционным методом. В качестве носителей выступали, преимущественно, пористое стекло, разнообразные глины, полисахариды, оксиды алюминия, синтетические полимеры, титан и прочие металлы. При этом последние используются чаще всего. Результативность адсорбции препарата на носителе определяется по пористости материала и удельной поверхности.

Механизм действия

Адсорбция ферментов на нерастворимых материалах отличается простотой. Она достигается при контакте водного раствора препарата с носителем. Он может проходить статическим или динамическим способом. Раствор фермента перемешивается со свежим осадком, к примеру, гидроксида титана. Затем в мягких условиях соединение высушивается. Активность фермента при такой иммобилизации сохраняется почти на все 100%. При этом удельная концентрация достигает 64 мг на грамм носителя.

Негативные моменты

К недостаткам адсорбции относят невысокую прочность при связывании фермента и носителя. В процессе изменений условий реакции могут отмечаться потеря элементов, загрязнение продуктов, десорбция белка. Для повышения прочности связывания носители предварительно модифицируют. В частности, материалы обрабатывают ионами металлов, полимерами, гидрофобными соединениями и прочими полифункциональными агентами. В ряде случаев модификации подвергают сам препарат. Но достаточно часто это приводит к уменьшению его активности.

Включение в гель

Этот вариант достаточно распространен благодаря своей уникальности и простоте. Этот способ подходит не только для индивидуальных элементов, но и для мультиэнзимных комплексов. Включение в гель может выполняться двумя методами. В первом случае препарат соединяют с водным раствором мономера, после чего выполняют полимеризацию. В результате возникает пространственная структура геля, содержащая в ячейках молекулы фермента. Во втором случае препарат вносится в раствор готового полимера. Затем его переводят в состояние геля.

Внедрение в полупрозрачные структуры

Суть данного метода иммобилизации состоит в отделении водного ферментного раствора от субстрата. Для этого используется полупроницаемая мембрана. Она пропускает низкомолекулярные элементы кофакторов и субстратов и задерживает большие молекулы ферментов.

Микрокапсулирование

Существует несколько вариантов внедрения в полупрозрачные структуры. Наибольший интерес из них представляют микрокапсулирование и включение белков в липосомы. Первый вариант был предложен в 1964 г. Т. Чангом. Он заключается в том, что ферментный раствор внедряется в замкнутую капсулу, стенки которой выполнены из полупроницаемого полимера. Возникновение мембраны на поверхности обуславливается реакцией межфазной поликонденсации соединений. Одно из них растворено в органической, а другое – в водной фазе. В качестве примера можно назвать образование микрокапсулы, получаемой поликонденсацией галогенангидрида себациновой к-ты (органическая фаза) и гексаметилендиамина-1,6 (соответственно, водная фаза). Толщина мембраны исчисляется в сотых долях микрометра. При этом величина капсул – сотни или десятки микрометров.

Включение в липосомы

Этот метод иммобилизации близок к микрокапсулированию. Липосомы представлены в ламеллярных или сферических системах липидных бислоев. Этот способ впервые был применен в 1970 г. Для выделения липосом из липидного раствора проводят выпаривание органического растворителя. Оставшаяся тонкая пленка диспергируется в водном растворе, в котором присутствует фермент. В ходе этого процесса происходит самосборка липидных бислойных структур. Достаточно популярны такие иммобилизованные ферменты в медицине. Это обуславливается тем, что большая часть молекул локализуется в липидном матриксе биологических мембран. Включенные в липосомы иммобилизованные ферменты в медицине являются важнейшим исследовательским материалом, позволяющим изучать и описывать закономерности процессов жизнедеятельности.

Образование новых связей

Иммобилизация путем формирования новых ковалентных цепей между ферментами и носителями считается наиболее массовым методом получения биокатализаторов промышленного назначения. В отличие от физических способов этот вариант обеспечивает необратимую и прочную связь молекулы и материала. Ее образование зачастую сопровождается стабилизацией препарата. Вместе с тем расположение фермента на расстоянии 1-й ковалентной связи относительно носителя создает определенные сложности в выполнении каталитического процесса. Молекулу отделяют от материала при помощи вставки. В качестве нее часто выступают поли- и бифункциональные агенты. Ими, в частности, являются гидразин, бромциан, глутаровый диальгедрид, сульфурилхлорид и пр. К примеру, для выведения галактозилтрансферазы между носителем и ферментом вставляют следующую последовательность —СН₂—NH—(СН₂)₅—СО—. В такой ситуации в структуре присутствует вставка, молекула и носитель. Все они соединяются ковалентными связями. Принципиальное значение имеет необходимость внедрения в реакции функциональных групп, не существенных для каталитической функции элемента. Так, как правило, гликопротеины присоединяются к носителю не через белковую, а через углеводную часть. В результате получают более устойчивые и активные иммобилизованные ферменты.

Клетки

Описанные выше способы считаются универсальными для всех типов биокатализаторов. К ним, в том числе, относят клетки, субклеточные структуры, иммобилизация которых приобретает в последнее время широкое распространение. Это обуславливается следующим. При иммобилизации клеток отпадает необходимость выделять и очищать ферментные препараты, внедрять в реакции кофакторы. В результате появляется возможность получать системы, которые осуществляют многостадийные непрерывно протекающие процессы.

Применение иммобилизованных ферментов

В ветеринарии, промышленности, других хозяйственных отраслях достаточно популярны препараты, полученные указанными выше способами. Выработанные на практике подходы обеспечивают решение проблем по осуществлению направленной доставки лекарств в организме. Иммобилизованные ферменты позволили получить медикаменты пролонгированного действия с минимальной аллергенностью и токсичностью. В настоящее время ученые решают проблемы, связанные с биоконверсией массы и энергии, используя микробиологические подходы. Между тем, существенный вклад в работу вносит и технология иммобилизованных ферментов. Перспективы развития представляются учеными достаточно широкими. Так, в будущем одна из ключевых ролей в процессе контроля над состоянием окружающей среды должна принадлежать новым видам анализа. В частности, речь о биолюминесцентном и иммуноферментном методах. Особое значение передовые подходы имеют в переработке лигноцеллюлозного сырья. Можно использовать иммобилизованные ферменты в качестве усилителей слабых сигналов. Активный центр может находиться под воздействием носителя, находящегося под ультразвуком, механическими нагрузками или подверженного фитохимическим превращениям.