При исследованиях веществ в органической химии применяется не один десяток различных качественных реакции, позволяющих определить содержание тех или иных соединений. Такой наглядный анализ позволяет сразу понять, присутствуют ли необходимые вещества, а если же их нет – существенно сократить дальнейшие опыты для их выявления. К таким реакциям относится и нингидриновая, являющаяся основной в визуальном определении аминосоединений.
Что это такое?
Нингидрин – это дикарбонильное соединение, содержащее одно ароматическое кольцо с присоединенным к нему гетероциклом, у второго атома которого находятся 2 гидроксильные группы (OH-). Это вещество получают прямым окислением инандиона - 1,3, и, следовательно, по международной номенклатуре оно имеет следующее название: 2,2 – дигидроксиинандион -1,3 (рис. 1).
Чистый нингидрин представляет собой кристаллы желтого или белого цвета, которые при нагревании хорошо растворяются в воде и других полярных органических растворителях, например, в ацетоне. Это довольно вредное вещество, при попадании на кожу в больших количествах или слизистые вызывает раздражение, в том числе и при вдыхании. Работать с этим соединением следует аккуратно и только в перчатках, так как при попадании на кожу дает реакцию с белками клеток кожи и окрашивает ее в фиолетовый цвет.
Вещества, поддающиеся реакции
Как было указано выше, нингидриновая реакция используется в первую очередь для визуального определения содержания аминосоединений:
- α-аминокислот (в том числе и в белках);
- аминосахаров;
- алкалоидов, содержащих –NH2 и -NH группы;
- различных аминов.
Следует отметить, что вторичные и третичные амины иногда реагируют очень слабо, поэтому чтобы подтвердить их наличие, необходимо проводить дополнительные исследования.
Для количественного определения используются различные методы хроматографии, например, бумажная (БХ), тонкослойная (ТСХ) или с промыванием твердых носителей раствором нингидрина в различных средах.
Данная реакция не является специфичной по отношению к аминосоединениям, так как вступать в нее реагент может со всеми сразу. Однако со стороны продуктов реакции она имеет особенность в виде выделения пузырьков углекислого газа (CO2), а это характерно только при взаимодействии с α-аминокислотами.
Особенности механизма
В литературе встречаются разные трактовки уравнения нингидриновой реакции. Какие-то исследователи опускают образование гидриндантина из 2-аминоинандиона, который при участии аммиака и нингидрина также образует красящее вещество под названием «пурпурный Руэмана» (или «синий Руэмана»), а другие, наоборот, предполагают только его участие без присутствия промежуточных аминопродуктов. В записи самой реакции также есть некоторые интересные моменты, в особенности это касается способов присоединения аминопроизводного нингидрина к основной его молекуле с образованием красителя. Также остается под вопросом указание места «гулящего водорода», полученного промежуточным амином из водной среды: оно может быть или в кетоновой группе, или рядом с –NH2.
В действительности нюанс с атомом H незначителен, так как его положение в соединении не играет особой роли в ходе реакции, поэтому на него не следует обращать внимание. Что касается пропуска одной из возможных стадий, то здесь причина кроется в теоретическом аспекте: до сих пор точный механизм образования пурпурного Руэмана точно не определен, поэтому можно встретить довольно разные схемы нингидриновой реакции.
Ниже будет предложен наиболее полный возможный ход взаимодействия реактива с аминосоединениями.
Механизм реакции
Вначале нингидрин взаимодействует с α-аминокислотой, присоединяя ее по месту отщепления гидрокси-групп и образуя продукт конденсации (рис. 2а). Затем последнее разрушается, выделяя промежуточный амин, альдегид и углекислый газ (рис. 2б). Из конечного продукта при присоединении нингидрина синтезируется структура пурпурного Руэмана (дикетонгидринденкетогидринамин, рис. 2в). Также указано возможное образование из промежуточного амина гидриндантина (восстановленный нингидрин), который в среде аммиака (а точнее, гидроксида аммония) с избытком самого реактива тоже превращается в красящее соединение (рис. 2г).
Образование гидриндантина было доказано самим Руэманом при действии сероводородом на молекулу нингидрина. Это соединение способно растворяться в карбонате натрия Na2CO3, окрашивая раствор в темно-красный цвет. А при добавлении разбавленной соляной кислоты гидриндантин выпадает в осадок.
Скорее всего, промежуточный амин, гидридантин, нингидрин и структура красителя из-за своей неустойчивости при нагревании находятся в некотором равновесии, что позволяет допустить наличие нескольких дополнительных стадий.
Данный механизм подходит для объяснения нингидриновой реакции и с другими аминосоединениями, исключение составляют побочные продукты, образующиеся в результате отщепления остальной части структуры от –NH2, -NH или -N.
Биуретовая проба и другие реакции на белки
Качественный анализ на пептидные связи даже непротеиновых структур может проходить не только с участием вышеописанного реактива. Однако в случае нингидриновой реакции на белки взаимодействие идет не по –CO-NH‒ группам, а по аминовым. Существует так называемая «биуретовая реакция», которая характеризуется добавлением в раствор с аминосоединениями ионов двухвалентной меди из CuSO4 или Cu(OH)2 в щелочной среде (рис. 3).
В ходе анализа при наличии необходимых структур раствор окрашивается в темно-синий цвет благодаря связыванию пептидных связей в цветной комплекс, что отличает один реактив от другого. Вот почему биуретовая и нингидриновая реакции являются универсальными по отношению к белковым и небелковым структурам с группой –CO-NH‒.
При определении циклических аминокислот используют ксантопротеиновую реакцию с концентрированным раствором азотной кислоты HNO3 , которая при нитровании дает желтую окраску. Капля реактива, попавшая на кожу, также проявляет желтую окраску, реагируя с аминокислотами в клетках кожи. Азотная кислота может оставлять ожоги, поэтому с ней также следует работать в перчатках.
Примеры взаимодействия с аминосоединениями
Нингидриновая реакция на α-аминокислоты дает хороший визуальный результат, исключением по цвету являются пролиновые и оксипролиновые структуры, которые реагируют с образованием желтой окраски. Возможное объяснение этому эффекту нашли в других условиях среды взаимодействия нингидрина с данными структурами.
Реакция с аминогруппой
Так как проба не специфична, визуальное обнаружение аланина с помощью нингидриновой реакции в смеси не представляется возможным. Однако методом бумажной хроматографии, при нанесении образцов различных α-аминокислот, их опрыскивании водным раствором нингидрина и проявлением в специальной среде, можно рассчитать количественный состав не только заявленного соединения, но и многих других.
Схематично взаимодействие аланина с нингидрином проходит по тому же принципу. Он присоединяется к реактиву по аминовой группе, а под действием активных ионов гидроксония (H3O+) отщепляется по месту связи углерода с азотом, распадаясь на уксусный альдегид (CH3COH) и углекислый газ (CO2). Другая молекула нингидрина присоединяется к азоту, вытесняя молекулы воды, и образуется красящая структура (рис. 4).
Реакция с гетероциклическим аминосоединением
Нингидриновая реакция с пролином является специфичной, особенно в хроматографических анализах, так как такого рода структуры в кислой среде сначала окрашиваются в желтый цвет, а затем в нейтральной приобретают пурпурное окрашивание. Исследователи объясняют это особенностью перестройки цикла в промежуточном соединении, на который влияет именно присутствие большого количества протонов водорода, дополняющих внешний энергетический уровень азота.
Разрушение гетероцикла не происходит, а другая молекула нингидрина присоединяется в нем по 4-му атому углерода. При дальнейшем нагревании полученная структура в нейтральной среде переходит в пурпурный Руэмана (рис.5).
Приготовление основного реактива
Нингидриновую пробу проводят разными растворами, в зависимости от растворения аминоструктур в тех или иных органических и неорганических соединениях.
Основным реактивом является приготовление 0,2 % раствора в воде. Это универсальная смесь, поскольку большинство соединений хорошо растворяются именно в H2O. Чтобы получить свежеприготовленный реактив, навеску 0,2 г химически чистого нингидрина разбавляют в 100 мл воды.
Стоит отметить, что для некоторых анализируемых растворов эта концентрация является недостаточной, поэтому могут приготовить 1 % или 2 % растворы. Это характерно для вытяжек из лекарственного сырья, поскольку в них содержатся различные классы аминосоединений.
При проведении хроматографических исследований растворы, например, при промывании смеси на твердом носителе через колонку, могут готовить на спирту, диметилсульфоксиде, ацетоне и других полярных растворителях ‒ все будет зависеть от растворителя определенных аминоструктур.
Применение
Нингидриновая реакция позволяет обнаружить в растворе многие аминосоединения, что определило ее как одну из первых для использования в качественном анализе органических веществ. Визуальное определение значительно сокращает количество опытов, в особенности при анализе малоизученных растений, лекарств и лекарственных форм, а также неизвестных растворов и смесей.
В криминалистике этот метод получил широкое распространение для определения наличия потожировых следов на любых поверхностях.
Даже несмотря на неспецифичность реакции, вывод нингидриновой реакции из химической практики невозможен, так как замены этого вещества на менее токсичные аналоги (например, оксолин) доказали, что они обладают худшей чувствительностью по отношению к аминогруппам и не дают хороших результатов при фотометрических анализах.
