Что лежит в основе гибридизации ДНК? Хотя двухцепочечная ДНК -последовательность в целом стабильная в физиологических условиях, изменение этих условий в лаборатории (как правило, путем повышения температуры окружающей среды) приведет к тому, что молекулы будут разделены на отдельные нити. Последние являются взаимодополняющими друг к другу, но могут также дополнять другие последовательности, присутствующие в их окружении. Опускание окружающей температуры позволяет однонитевым молекулам отжигать или «гибридизоваться» друг с другом. Это и есть метод гибридизации ДНК.
Понятие с точки зрения молекулярной биологии
Ученые, занимающиеся как репликацией ДНК, так и транскрипцией ДНК в РНК, полагаются на скрещивание нуклеотидов между собой и методы молекулярной биологии. Сюда включаются Саузерн-блоты и Нозерн-блоты, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и большинство подходов к секвенированию и гибридизации ДНК-РНК.
Применение
Гибридизация является основным свойством нуклеотидных последовательностей и используется в многочисленных методах молекулярной биологии. Общая генетическая взаимосвязь двух видов может быть определена путем гибридизации сегментов их ДНК (ДНК-ДНК-гибридизация). Из-за сходства последовательностей между близкородственными организмами требуется более высокая температура для таяния таких гибридов ДНК по сравнению с более удаленными организмами. Различные методы используют гибридизацию для определения происхождения образца ДНК, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В другом методе короткие последовательности ДНК гибридизуются с клеточной мРНК для идентификации экспрессируемых генов. Фармацевтические компании изучают использование антисмысловой РНК для связывания с нежелательной мРНК, предотвращая рибосому от перевода мРНК в белок.
ДНК-ДНК-гибридизация обычно относится к методу молекулярной биологии, который измеряет степень генетического сходства между пулами последовательностей ДНК. Он обычно используется для определения генетического расстояния между двумя организмами. Это широко использовалось в филогении и таксономии.
Методология
ДНК одного организма метили, затем смешивали с не меченной ДНК, которую можно было сравнить с ней. Смесь инкубируют, чтобы позволить цепям ДНК диссоциировать и затем охлаждаться с образованием возобновленной гибридной двухцепочечной ДНК. Гибридизированные последовательности с высокой степенью сходства будут более жестко связываться и требуют больше энергии для их разделения: т. е. они разделяются при нагревании при более высокой температуре, чем разнородные последовательности, процесс, известный как «плавление ДНК».
Плавление ДНК
Оценивая профиль плавления гибридизованной ДНК, двухцепочечную ДНК связывают с так называемой "колонкой", а получившуюся смесь нагревают. На каждом этапе колонку промывают, а последовательности ДНК, которые плавятся, становятся одноцепочечными и смывают колонну. Температуры, при которых помеченная ДНК выходит из колонки, отражает количество сходства между последовательностями (и образец самосгибания служит в качестве контроля). Эти результаты объединены, чтобы определить степень генетического сходства между организмами. Как утверждает современная микробиология, гибридизация ДНК невозможно без понимания этих вещей.
Когда несколько видов рибонуклеиновой (или дизоксирибонуклеиновой) кислоты сравниваются таким образом, значения сходства позволяют размещать виды в филогенетическом дереве. Следовательно, это один из возможных подходов к проведению молекулярной систематики. Чарльз Сибли и Джон Альквист, пионеры этой техники, использовали ДНК-ДНК-гибридизацию для изучения филогенетических отношений птиц (систематика Сибли-Алквиста) и приматов.
Значение для биологии
ДНК-ДНК-гибридизация является золотым стандартом для различения бактериальных видов с величиной сходства более 70%, что указывает на то, что сравниваемые штаммы относятся к разным видам. В 2014 году был предложен порог 79% сходства для разделения бактериального подвида.
Критики утверждают, что техника неточна для сравнения близких видов, так как любая попытка измерить различия между ортологическими последовательностями между организмами перегружена гибридизацией паралоговых аналогов в геноме организма. Секвенирование ДНК и вычислительные сравнения последовательностей в настоящее время обычно являются методом определения генетического расстояния, хотя этот подход все еще используется в микробиологии, чтобы помочь идентифицировать бактерии.
Современный способ заключается в проведении гибридизации ДНК-ДНК в силиконе с использованием полностью или частично секвенированных геномов. GGDC, разработанный в DSMZ, является наиболее точным известным инструментом для вычисления DDH-аналогичных значений. Среди других алгоритмических улучшений он решает проблему с паралогическими последовательностями, тщательно фильтруя их из совпадений между двумя последовательностями генома.
Метод FISH
Флуоресцентная гибридизация молекул ДНК (Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) представляет собой лабораторный метод, используемый для обнаружения и определения последовательности ДНК, часто на определенной хромосоме.
В 1969 году Джозеф Галл и Мэри Лу Парду опубликовали документ, демонстрирующий, что радиоактивные копии последовательности рибосомной ДНК могут быть использованы для обнаружения комплементарных последовательностей ДНК в ядре лягушечьего яйца. Начиная с этих оригинальных наблюдений, многие уточнения повысили универсальность и чувствительность процедуры до такой степени, что гибридизация in situ ("на своем месте", латынь) в настоящее время считается важным инструментом в цитогенетике. (Термином in situ в настоящее время также обозначают начальную стадию роста карциномы, когда в патологический процесс вовлечена лишь эпителиальная ткань.)
Последовательность флуоресцентной гибридизации
РНК-зонды могут быть сконструированы для любого гена или любой последовательности внутри гена для визуализации мРНК lncRNA и miRNA в тканях и клетках. FISH используется путем изучения цикла клеточного размножения, в частности интерфазы ядер для любых хромосомных аномалий. FISH позволяет анализировать большую серию архивных случаев, намного легче идентифицировать выявленную хромосому, создавая зонд с искусственным хромосомным основанием, который будет привлекать подобные хромосомы.
Сигналы гибридизации для каждого зонда, когда обнаруживается аномалия ядра: каждый зонд для обнаружения мРНК и lncRNA состоит из 20 пар олигонуклеотидов, каждая пара покрывает пространство 40-50 б. п. Для обнаружения мРНК зонды используют запатентованную химию.
Гибридизация с ДНК-зондами
Зонды часто получают из фрагментов ДНК, которые были выделены, очищены и амплифицированы для использования в проектировании генома человека. Размер человеческого генома настолько велик по сравнению с длиной, которая может быть секвенирована напрямую, что необходимо разделить его на фрагменты. В конечном счете эти фрагменты приводились в порядок путем переваривания копии каждого фрагмента в еще более мелкие элементы с использованием эндонуклеаза, специфичных для последовательностей, для измерения размера каждого небольшого фрагмента с использованием эксклюзионной хроматографии с использованием этой информации для определения, где большие части перекрывались друг с другом.
Чтобы сохранить элементы с их индивидуальными последовательностями ДНК, фрагменты были добавлены в систему постоянно повторяющихся популяций бактерий. Клональные популяции бактерий, каждая популяция, поддерживающая единую искусственную хромосому, хранятся в различных лабораториях по всему миру. Искусственные хромосомы (BAC) можно выращивать, извлекать и помечать в любой лаборатории, содержащей библиотеку. Геномные библиотеки часто называются в честь учреждений, в которых они были разработаны. Примером может служить библиотека RPCI-11, названная в честь Института рака Розуэлла в Буффало (Нью-Йорк, США). Эти фрагменты составляют порядка 100 тысяч базовых пар и являются основой большинства зондов FISH.
