Культивирование клеток сильно зависит от условий. Они изменяются для каждого типа клеток, но обычно состоят из подходящего сосуда с субстратом или средой, которые обеспечивают необходимые питательные вещества (аминокислоты, углеводы, витамины, минералы), факторы роста, гормоны и газы (CO2, O2) и регулируют физико-химическую среду (буфер рН, осмотическое давление, температуру). Большинство клеток требуют поверхности или искусственного субстрата (адгезивная или монослойная культура), тогда как другие могут быть свободно размножены в культуральной среде (суспензионная культура). Продолжительность жизни большинства клеток генетически определена, но некоторые объекты культивирования клеток были трансформированы в бессмертные клетки, которые будут воспроизводиться бесконечно, если для этого будут созданы оптимальные условия.
Определение
С определением здесь все довольно просто. На практике термин «культура клеток» теперь относится к культивированию клеток, полученных из многоклеточных эукариотов, особенно животных клеток, в отличие от других типов культуры. Историческое развитие и методы культивирования тесно связаны с культурой тканей и культурой органов. Вирусная культура также связана с клетками как хозяевами для вирусов.
История
Лабораторная техника получения и культивирования клеток, отделенных от исходного источника ткани, стала более устойчивой в середине 20 века. Основные прорывы в этой области были совершены учеными из Йельского университета.
Прорыв в середине века
Изначально получение и культивирование клеток практиковалось для того, чтобы найти панацею от множества опасных вирусов. Рядом исследователей было открыто, что многие штаммы вирусов могут спокойно жить, процветать и размножаться на искусственно выращиваемых клетках животных или даже целых органах, которые удерживаются автономно в специальных колбах. Как правило, для подобных испытаний используются клетки органов животных, максимально приближенных к человеку - к примеру, высших приматов вроде шимпанзе. Все эти открытия были совершены в 1940-х годах, когда эксперименты над людьми в силу определенных причин были наиболее актуальны.
Методология
Клетки могут быть выделены из тканей для культуры ex vivo несколькими способами. Они могут быть легко очищены от крови, однако только белые клетки способны к росту в культуре. Клетки могут быть выделены из твердых тканей путем переваривания внеклеточного матрикса с использованием ферментов, таких как коллагеназа, трипсин или проназа, перед перемешиванием ткани для высвобождения клеток в суспензию. Альтернативно кусочки ткани могут быть помещены в ростовые среды, а клетки, которые растут, доступны для культуры. Этот метод известен как культура эксплантатов.
Клетки, которые культивируются непосредственно у субъекта, известны как первичные клетки. За исключением некоторых, полученных из опухолей, большинство первичных клеточных культур имеют ограниченный срок службы.
Бессмертные и стволовые клетки
Установленная или иммортализованная клеточная линия приобрела способность размножаться бесконечно либо через случайную мутацию, либо преднамеренную модификацию, такую как искусственная экспрессия гена теломеразы. Многочисленные клеточные линии хорошо известны как типичные типы клеток.
Массовая культура линий клеток животных имеет основополагающее значение для производства вирусных вакцин и других продуктов биотехнологии. Культура стволовых клеток человека используется для расширения их числа и дифференциации клеток на различные типы, пригодные для трансплантации. Культивирование клеток человека (стволовых) также используется для сбора молекул и экзосом, высвобождаемых стволовыми клетками для целей терапевтического использования.
Связь с генетикой
Биологические продукты, полученные с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в культурах животных, включают ферменты, синтетические гормоны, иммунобиологические (моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины) и противораковые агенты. Хотя многие более простые белки могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, которые гликозилированы (модифицированы углеводами), в настоящее время должны быть сделаны в клетках животных.
Важным примером такого комплексного белка является гормон эритропоэтин. Расходы на выращивание клеточных культур млекопитающих высоки, поэтому ведутся исследования по созданию таких сложных белков в клетках насекомых или на высших растениях. Использование отдельных эмбриональных клеток и соматических эмбрионов в качестве источника прямого переноса генов путем бомбардировки частицами, экспрессии транзитных генов, и конфокальная микроскопия является одной из областей ее применений. Культивирование растительных клеток является самой распространенной формой этой практики.
Тканевые культуры
Тканевая культура - это выращивание тканей или клеток, отделенных от организма. Этот процесс обычно облегчается с использованием жидкой, полутвердой или твердой среды роста, такой как бульон или агар. Тканевая культура обычно относится к культуре животных клеток и тканей, при этом для растений используется более конкретный термин - культивирование клеток и тканей растений. Термин «тканевая культура» был придуман американским патологом Монтроузом Томасом Берроузом.
История тканевой культуры
В 1885 году Вильгельм Ру снял участок медуллярной пластины эмбриональной курицы и несколько дней поддерживал ее в теплом солевом растворе, устанавливая основной принцип тканевой культуры. В 1907 году зоолог Росс Гранвилл Харрисон продемонстрировал рост эмбриональных клеток лягушки, которые привели бы к возникновению нервных клеток в среде свернувшейся лимфы. В 1913 году Э. Штайнхардт, C. Исраэль и Р. А. Ламберт выращивали вирус коровьей оспы в фрагментах роговой ткани морской свинки. Это уже было чем-то куда более продвинутым, чем культивирование клеток растений.
От прошлого к будущему
Готлиб Хаберландт впервые указал на возможность культивирования изолированных тканей растений. Он предположил, что этим методом можно определить возможности отдельных клеток через тканевую культуру, а также взаимное влияние тканей друг на друга. Поскольку оригинальные утверждения Хаберланда были реализованы, методы тканевой и клеточной культуры стали активно применяться, что привело к новым открытиям в биологии и медицине. Его первоначальная идея, представленная в 1902 году, называлась тотипотенциальностью: «Теоретически все растительные клетки способны породить полное растение». Культивирование культур клеток в то время продвинулось резко вперед.
В современном использовании тканевая культура обычно относится к росту клеток из ткани многоклеточного организма in vitro. Условия культивирования клеток при этом не очень важны. Эти клетки могут быть выделенными из донорского организма, первичными клетками или иммортализованной клеточной линией. Клетки омывают культуральной средой, которая содержит питательные вещества и источники энергии, необходимые для их выживания. Термин "тканевая культура" часто используется взаимозаменяемо с клеточной культурой.
Применение
Буквальное значение культуры тканей относится к культивированию кусочков ткани, то есть к эксплантационной культуре.
Тканевая культура является важным инструментом для изучения биологии клеток из многоклеточных организмов. Она обеспечивает in vitro модель ткани в четко определенной среде, которой можно легко манипулировать и анализировать ее.
В культуре тканей животных клетки можно выращивать в виде двумерных монослоев (обычная культура) или внутри волокнистых лесов или гелей для достижения более натуралистических трехмерных тканеподобных структур (3D-культура). Эрик Саймон в докладе гранта NIH SBIR 1988 года показал, что электроспиннинг можно использовать для получения полимерных волокнистых каркасов нано- и субмикронного масштаба, специально предназначенных для использования в качестве клеточных и тканевых субстратов in vitro.
Это раннее использование электропроводных волокнистых решеток для клеточной культуры и тканевой инженерии показало, что различные типы клеток будут прилипать и размножаться на поликарбонатных волокнах. Было отмечено, что, в отличие от сплюснутой морфологии, обычно наблюдаемой в 2D-культуре, клетки, выращенные на электрошнурных волокнах, демонстрируют более округлую 3-мерную морфологию, обычно наблюдаемую в тканях in vivo.
Культура растительной ткани, в частности, связана с выращиванием целых растений из мелких кусочков растительных волокон, культивируемых в среде.
Различия в моделях
Исследования в тканевой инженерии, в области стволовых клеток и молекулярной биологии в первую очередь включают в себя выращивание клеточных культур на плоских пластиковых блюдах. Этот метод известен как двумерная (2D) клеточная культура и впервые был разработан Вильгельмом Ру, который в 1885 году удалил часть медуллярной пластинки эмбриональной курицы и поддерживал ее в теплом физиологическом растворе в течение нескольких дней на плоском стекле.
От продвижения полимерной технологии возникла современная стандартная пластиковая посуда для двумерной клеточной культуры, широко известная как чашка Петри. Юлий Рихард Петри, немецкий бактериолог, как правило, упоминается в научной литературе как автор этого изобретения, работал помощником Роберта Коха. Сегодня различные исследователи также используют культуральные лабораторные колбы, конические и даже одноразовые мешки, подобные тем, которые используются в одноразовых биореакторах.
Помимо культуры хорошо устоявшихся иммортализованных клеточных линий, клетки из первичных эксплантов множества организмов могут культивироваться в течение ограниченного периода времени до появления чувствительности. Культурные первичные клетки широко использовались в исследованиях, как в случае кератоцитов рыб в исследованиях миграции клеток. Среды для культивирования клеток при этом могут использоваться самые разные.
Культуры растительных клеток обычно выращивают в виде культур клеточной суспензии в жидкой среде или в культурах каллюса на твердой среде. Культура недифференцированных растительных клеток и калли требует надлежащего баланса гормонов роста растений ауксина и цитокинина.
