Методика окраски по Граму – экспресс-метод, позволяющий определить вид бактерий. Технология выявления патогена разработана бактериологом Гансом Грамом. Он был необычным человеком, скромным. В своей работе он сказал: «Я публикую методику окраски, заведомо зная, что она имеет некоторые недостатки, но я не теряю надежды, что мой метод будет доработан и станет полезным». Так и произошло. Его технология стала одной из ведущих при определении типа бактерий. Методика окраски по Граму основана на строении прокариот, из-за чего бактерии приобретают тот или иной оттенок.
Рекомендации
Прежде чем приступить к окрашиванию, необходимо подготовить рабочее место и образец. От качества последнего зависит, насколько хорошим будет результат. К примеру, для анализа берут мокроту глубокого кашля, а не просто слюну.
При работе с образцами обязательно соблюдаются правила безопасности. Во время работы на руках должны быть перчатки. Также стоит быть внимательным при работе со спиртом, ацетоном. Эти вещества огнеопасны и легко воспламеняются при нагревании.
При работе с предметными стеклами их берут аккуратно пинцетом или двумя пальцами за боковые края так, чтобы не трогать мазок.
Подготовка к работе
Начинается методика окраски по Граму с подготовки себя к предстоящей работе. На руки обязательно надеваются стерильные перчатки, длинные волосы должны быть убраны, подвязаны. Рабочее место должно располагаться в стерильном, хорошо проветриваемом помещении. Перед проведением манипуляции обязательно проверяется работоспособность микроскопа.
Следующим шагом будет подготовка предметных стекол. Если они недостаточно чистые, то стекла промывают под проточной водой с мылом. Это поможет удалить грязь, жир. Обязательно поверхность обрабатывается спиртом или другим способом, используемым в лаборатории.
Подготовка образца
Методика окраски по Граму предполагает подготовку образца. Для этого берут предметное стекло и на его центр аккуратно помещают образец. Методика окраски мазков по Граму дает возможность увидеть тип бактерий, культивируемых в чашке Петри.
Для начала работы на стекло наносят тонкий слой исследуемой жидкости. Не стоит ждать более суток от начала забора материала до проведения анализа, так как у многих патогенов разрушается клеточная стенка, и реакция на окрашивание становится совершенно непредсказуемой. Если же предполагается начать исследование тканей, то на предметное стекло стоит нанести пару капель материала. Жидкость распределяется по стеклу ровным слоем ребром другого стекла. Образцу дают подсохнуть.
Если для окраски берут образец из чашки Петри, то процедуру забора материала проводят петлей. А при исследовании мазка его прижимают к предметному стеклу другим стеклом.
Фиксация образца
Методика окраски препарата по Граму предполагает фиксацию образца. Под действием тепла бактерии пристают к стеклу и не смываются.
Для того чтобы закрепить мазок, необходимо провести над горелкой предметное стекло. Нельзя перегревать стекло, чтобы в образце не появилось изменений.
Можно зафиксировать образец метанолом. Для этого на стекло необходимо нанести пару капель метилового спирта, а излишки слить. Стекло просушивается естественным способом. Этот метод предпочтительнее из-за того, что он меньше повреждает исследуемые клетки и показывает более чистый фон.
Окрашивание
Методика приготовления мазка препаратов окраски по Граму предполагает окрашивание в емкости, в которую будет помещен образец. Обычно для этого используется лоток или стеклянное блюдце. В него помещают предметное стекло с препаратом так, чтобы жидкость стекала в лоток.
Сначала на образец наносится раствор кристаллического фиолетового или генцианово-фиолетового. Его набирают в пипетку и несколько капель наносят на препарат. Через минуту проводят оценку результата. Все грамположительные патогены окрасятся в фиолетовый цвет.
Затем краситель смывают водой так, чтобы она слегка обмыла мазок. Далее на образец наносится йод и оставляется на минуту. После этого его так же аккуратно смывают. После этой процедуры на стекло наносится обесцвечивающее вещество. Это может быть раствор ацетона и спирта. Раствором обрабатывают мазок до тех пор, пока не исчезнет фиолетовый оттенок.
На мазок наносится контрастный краситель. Это может быть фуксин или сафран. Он позволяет создать контраст между грамотрицательными и грамположительными бактериями. В результате воздействия препарата грамотрицательные патогены окрашиваются в фуксиевый цвет. Краситель смывают водой.
Завершающим этапом является просушивание предметного стекла. После этого методика окраски по Граму (в микробиологии она используется довольно часто) считается завершенной.
Оценка результатов
Предметное стекло помещают под микроскоп. Грамположительные бактерии в мазке будут окрашены в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии окрасятся в розовый или красный оттенок. Такое разнообразие возникает в результате особенности строения стенок патогенов. В одни проникает только фиолетовый краситель, а в другие – фуксиевый.
К ошибочному результату может привести длительное нахождение предметного стекла под действием обесцвечивающей жидкости. Поэтому процедуру проводят дважды, чтобы убедиться в правильности диагноза. Повторный анализ позволяет удостовериться, что окраска проведена правильно.
Во время работы с патогенными микроорганизмами всегда соблюдайте осторожность, так как от этого зависит ваше здоровье.
