Рекомбинантная ДНК - это молекулы, образованные лабораторными методами генетической рекомбинации для объединения генетического материала из множества источников. Она возможна потому, что молекулы ДНК всех организмов имеют одинаковую химическую структуру и отличаются только нуклеотидной последовательностью в ее пределах.
Создание
Молекулярное клонирование - это лабораторный процесс, используемый для создания рекомбинантной ДНК. Это один из двух наиболее широко используемых методов, наряду с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Он позволяет управлять репликацией любой конкретной последовательности ДНК, выбранной экспериментатором.
Есть два фундаментальных различия между методами рекомбинантных ДНК. Одним из них является то, что молекулярное клонирование включает репликацию в живой клетке, а ПЦР - в пробирке. Другое отличие состоит в том, что первый метод допускает вырезание и вставку последовательностей ДНК, а второй усиливается путем копирования существующей очередности.
Вектор ДНК
Получение рекомбинантной ДНК требует клонирующего вектора. Он происходит от плазмид или вирусов и представляет собой относительно небольшой сегмент. Выбор вектора для молекулярного клонирования зависит от выбора организма-хозяина, размера клонируемой ДНК и от того, должны ли экспрессироваться чужеродные молекулы. Сегменты могут быть объединены с использованием различных методов, таких как клонирование рестриктазы / лигазы или Сборки Гибсона.
Клонирование
В стандартных протоколах клонирование включает семь этапов.
- Выбор организма-хозяина и вектора клонирования.
- Получение ДНК-вектора.
- Формирование клонируемой ДНК.
- Создание рекомбинантной ДНК.
- Введение ее в организм хозяина.
- Отбор организмов, ее содержащих.
- Выбор клонов с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами.
После трансплантации в организм хозяина чужеродные молекулы, содержащиеся в рекомбинантной конструкции, могут экспрессироваться или неэкспрессироваться. Экспрессия требует реструктуризации гена для включения последовательностей, которые необходимы для продуцирования ДНК. Она используется трансляционным аппаратом хозяина.
Как работает
Рекомбинантная ДНК работает, когда клетка-хозяин экспрессирует белок из рекомбинантных генов. Экспрессия зависит от окружения гена набором сигналов, которые обеспечивают инструкции для его транскрипции. Они включают в себя промотор, связывание рибосомы и терминатор.
Проблемы возникают, если ген содержит интроны или сигналы, которые действуют как терминаторы для бактериального хозяина. Это приводит к преждевременному прекращению. Рекомбинантный белок может быть неправильно обработан, свернут или подвергнут разложению. Его производство в эукариотических системах обычно происходит в дрожжах и нитчатых грибах. Использование животных клеток затруднено из-за того, что многим нужна прочная опорная поверхность.
Свойства организмов
Организмы, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, имеют явно нормальные фенотипы. Их внешний вид, поведение и метаболизм обычно не изменяются. Единственный способ продемонстрировать наличие рекомбинантных последовательностей - это исследовать саму ДНК с использованием теста полимеразной цепной реакции.
В некоторых случаях рекомбинантная ДНК может оказывать вредное воздействие. Это может случиться, когда ее фрагмент, содержащий активный промотор, располагается рядом с ранее молчащим геном клетки-хозяина.
Использование
Технология рекомбинантной ДНК широко используется в биотехнологии, медицине и исследованиях. Ее белки и другие продукты можно найти практически в каждой западной аптеке, ветклинике, кабинете врача, медицинской или биологической лаборатории.
Наиболее распространенным применением является фундаментальное исследование, в котором технология важна для большинства современных работ в биологических и биомедицинских науках. Рекомбинантная ДНК используется для идентификации, картирования и последовательности генов, а также для определения их функции. Зонды рДНК используются для анализа экспрессии генов в отдельных клетках и в тканях целых организмов. Рекомбинантные белки используются в качестве реагентов в лабораторных экспериментах. Некоторые конкретные примеры приведены ниже.
Рекомбинантный химозин
Найденный в сычуге, химозин представляет собой фермент, необходимый для производства сыра. Это была первая генетически модифицированная пищевая добавка, используемая в промышленности. Микробиологически продуцированный рекомбинантный фермент, структурно идентичный ферменту, полученному от теленка, стоит дешевле и производится в больших количествах.
Рекомбинантный человеческий инсулин
Практически полностью заменил инсулин, полученный из животных источников (например, свиней и крупного рогатого скота) для лечения инсулинозависимого диабета. Рекомбинантный инсулин синтезируется путем введения гена человеческого инсулина в бактерии рода этерихий или дрожжи.
Гормон роста
Назначается пациентам, у которых гипофиз генерирует недостаточное количество гормона роста для поддержания нормального развития. До того, как стал доступен рекомбинантный гормон роста, его получали из гипофиза трупов. Эта небезопасная практика привела к тому, что у некоторых пациентов развилась болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Рекомбинантный фактор свертывания крови
Это свертывающий кровь белок, который вводят пациентам с формами гемофилии с нарушением свертываемости крови. Они не способны продуцировать фактор VIII в достаточных количествах. До разработки рекомбинантного фактора VIII белок получался путем обработки большого количества крови человека от нескольких доноров. Это несло очень высокий риск передачи инфекционных заболеваний.
Диагностика заражения ВИЧ
Каждый из трех широко используемых методов диагностики ВИЧ-инфекции был разработан с использованием рекомбинантной ДНК. Тест на антитела использует ее белок. Он определяет наличие генетического материала ВИЧ с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Разработка теста стала возможной благодаря молекулярному клонированию и анализу последовательности геномов ВИЧ.
