Иммерсионный объектив является одним из ключевых компонентов современного оптического микроскопа. Именно благодаря ему удается значительно расширить возможности микроскопа по увеличению и разрешению.
Устройство светового микроскопа и роль объектива
Световой микроскоп состоит из нескольких основных частей:
- Источник света (лампа)
- Конденсор - фокусирует свет на образце
- Предметный столик - для размещения образца
- Тубус с набором объективов и окуляров
Объектив выполняет в микроскопе важнейшую функцию - формирует первичное увеличенное действительное изображение образца. От качества объектива напрямую зависит четкость, яркость и информативность получаемого микроскопического изображения.
Что представляет собой иммерсионный объектив светового микроскопа
Иммерсионный объектив отличается от обычных микроскопических объективов наличием вставки из прозрачного стекла или кварца, заполняемой специальной жидкостью - иммерсионным маслом. Благодаря этому между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом с образцом создается иммерсионный слой.
Принцип работы иммерсионного объектива основан на сведении к минимуму преломления светового пучка на границе раздела "объектив-иммерсионная жидкость". Это позволяет максимально эффективно использовать числовую апертуру объектива и получать изображения с беспрецедентно высоким разрешением.
Типы иммерсионных объективов
Различают несколько типов иммерсионных объективов, которые классифицируют в зависимости от используемой иммерсионной жидкости:
- Для масляной иммерсии
- Для водной иммерсии
- Для глицериновой иммерсии
Наиболее распространены масляные иммерсионные объективы. В качестве иммерсионной жидкости для них используется специальное синтетическое масло (например, α-монобромнафталин) с высоким и стабильным показателем преломления - около 1,515.
Достоинства масляно-иммерсионных объективов:
- Максимальная числовая апертура - до 1,4
- Разрешение до 200 нм
- Яркое изображение
Для водной иммерсии в качестве жидкости используется дистиллированная вода (n=1,33). Такие объективы дешевле, но уступают по основным характеристикам масляным. Их преимущество - простота и безопасность при работе.
Практические рекомендации по использованию иммерсионных объективов
Перед началом работы с иммерсионным объективом необходимо выполнить ряд подготовительных действий.
- Тщательно очистить фронтальную линзу объектива и покровное стекло от пыли, жирных и других загрязнений
- Проверить наличие и чистоту иммерсионной жидкости, при необходимости заменить ее или долить в кювету объектива
- Убедиться, что устройство микроскопа позволяет достичь требуемого увеличения и числовой апертуры в режиме иммерсии
Правила работы с иммерсионным объективом:
- Наносить иммерсионную жидкость только на покровное стекло с образцом
- Аккуратно и медленно опускать объектив, не допуская соприкосновения оптики с образцом
- После завершения работы снять остатки иммерсионной жидкости и тщательно очистить объектив специальными средствами (ксилол, этанол)
Достоинства и ограничения иммерсионной микроскопии
Главное достоинство иммерсионной микроскопии - возможность получения изображений с рекордным разрешением вплоть до 200 нм.
Однако данный метод имеет и некоторые ограничения:
- Невозможность использования больших увеличений для толстых образцов
- Узкая глубина резкости
- Повышенные требования к точности фокусировки и фиксации положения образца
Все это накладывает определенные сложности при проведении иммерсионных исследований и требует от оператора микроскопа высокой квалификации и навыков работы.
Устройство светового микроскопа: дополнительные функциональные узлы
Помимо основных функциональных элементов, в конструкцию современных микроскопов часто входят дополнительные узлы и системы, расширяющие их возможности.
- Система подсветки. Для улучшения освещения образцов применяются светодиодные или галогенные подсветки. Они монтируются либо в корпусе микроскопа, либо в опорной подставке.
- Поворотный носитель образцов. Механическая система, позволяющая вращать предметный столик с закрепленным на нем образцом вокруг вертикальной оси. Используется для исследования анизотропных объектов в поляризованном свете.
- Фото- и видеофиксация. Возможность подключения цифровых фото- или видеокамер через специальные адаптеры к одному из выходных портов тринокулярной насадки. Позволяет записывать и анализировать микроскопические изображения.
- Управление с ЭВМ. Некоторые модели микроскопов имеют USB или LAN порты для подключения к компьютеру или локальной сети. Это дает возможность удаленно управлять функциями микроскопа и получать изображения в цифровом виде.
- Механизм автофокусировки. Автоматическая система точной фокусировки за счет непрерывного движения предметного столика с образцом вверх или вниз относительно неподвижного объектива. Используется преимущественно в высокоточных измерительных комплексах.
Особенности иммерсионных исследований биологических образцов
Иммерсионный микроскоп широко используется в биологических исследованиях для изучения различных клеточных и тканевых структур. Однако существует ряд особенностей, с которыми следует считаться при работе с такими объектами:
- Фиксация образцов. Живые биологические образцы содержат до 70-90% воды, поэтому их необходимо предварительно химически или термически фиксировать для предотвращения деградации.
- Окрашивание. В связи с малыми размерами многих биообъектов и слабым поглощением света ими, применяют флуоресцентные красители или гистологические красители для дополнительного контрастирования препаратов.
- Осмотр тонких срезов. Биологические образцы часто исследуют в виде очень тонких (до 20-30 нм) срезов или сколов. Это требует наибольшей аккуратности при работе с ними и настройке микроскопа.
- Дегидратация образцов. В ходе исследования из водных биообъектов под влиянием иммерсионной жидкости происходит вымывание воды, что приводит к их усадке и деформации со временем. Поэтому требуется учитывать максимальное время осмотра образца в иммерсионном режиме перед наступлением необратимых изменений.
- Выбор иммерсионной жидкости. При исследовании биообъектов предпочтительно использовать водные иммерсионные среды взамен токсичных масляных жидкостей, для максимального снижения риска нанесения ущерба живому биоматериалу.
