Поглощение и дальнейшее переизлучение света неорганическими и органическими средами является результатом фосфоресценции или флуоресценции. Разница между феноменами состоит в продолжительности интервала между световым поглощением и испусканием потока. При флуоресценции эти процессы происходят практически одновременно, а при фосфоресценции – с некоторым опозданием.
Историческая справка
В 1852 г. британский ученый Стокс впервые описал флуоресценцию. Он ввел новый термин в результате выполненных экспериментов с плавиковым шпатом, который испускал красный свет под воздействием ультрафиолета. Стокс отметил интересное явление. Он выявил, что длина волны при флуоресцентном излучении всегда больше, чем у потока света возбуждения.
Для подтверждения гипотезы в 19-м столетии было проведено множество экспериментов. Они показали, что разнообразные образцы флуоресцируют под действием ультрафиолета. Среди материалов, в числе прочего, были кристаллы, смолы, минералы, хлорофилл, лекарственное сырье, неорганические соединения, витамины, масла. Непосредственное же применение красителей для проведения биологических анализов началось только в 1930 г.
Флуоресцентная микроскопия: описание
Некоторые из материалов, использованных в исследованиях первой половины 20-го столетия, обладали высокой специфичностью. Благодаря показателям, которые не могли быть достигнуты контрастными способами, метод флуоресцентной микроскопии стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Немаловажное значение полученные результаты имели и для материаловедения.
Какие преимущества имеет метод флуоресцентной микроскопии? С помощью новых материалов стало возможным выделение высокоспецифичных клеток и субмикроскопических компонентов. Флуоресцентный микроскоп позволяет обнаружить отдельные молекулы. Разнообразные красители позволяют идентифицировать несколько элементов одновременно. Несмотря на ограниченность пространственного разрешения оборудования дифракционным пределом, который, в свою очередь, зависит от специфических свойств образца, выявление молекул ниже этого уровня также вполне возможно. Различные образцы после облучения проявляют автофлуоресценцию. Это явление достаточно широко применяется в петрологии, ботанике, полупроводниковой промышленности.
Особенности
Изучение животных тканей либо патогенных микроорганизмов зачастую осложняется или слишком слабой, или очень сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Однако значение в исследованиях приобретает внесение в материал компонентов, возбуждаемых на конкретной длине волны и испускающих световой поток необходимой интенсивности. Флуорохромы выступают в качестве красителей, способных самостоятельно прикрепляться к структурам (невидимым или видимым). При этом они отличаются высокой избирательностью относительно мишеней и квантовым выходом.
Флуоресцентная микроскопия стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Они обладали определенными профилями интенсивности испускания и возбуждения и были нацелены на конкретные биологические мишени.
Выявление отдельных молекул
Часто в идеальных условиях можно зарегистрировать свечение отдельного элемента. Для этого, кроме прочего, нужно обеспечить достаточно низкий шум детектора и оптический фон. Молекула флуоресцеина до разрушения вследствие фотообесцвечивания может испускать до 300 тыс. фотонов. При 20 % собираемости и эффективности процесса их можно зарегистрировать в количестве порядка 60 тыс.
Флуоресцентная микроскопия, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут.
Сложности
Ключевой проблемой выступает подавление шума от оптического фона. В связи с тем, что многие из материалов, используемых в конструкции фильтров и линз, проявляют некоторую автофлуоресценцию, усилия ученых на начальных этапах были ориентированы на выпуск компонентов, обладающих малой флуоресценцией. Однако последующие эксперименты привели к новым выводам. В частности, было установлено, что флуоресцентная микроскопия, основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока.
Механизм
Принципы флуоресцентной микроскопии, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Она возникает на границе сред с различными показателями преломления. В данном случае световой пучок проходит сквозь призму. Она обладает высоким параметром преломления.
Призма прилегает к водному раствору или стеклу с низким параметром. Если поток света направляется на нее под углом, который больше критического, пучок полностью отражается от границы раздела. Это явление, в свою очередь, вызывает нераспространяющуюся волну. Другими словами, генерируется электромагнитное поле, проникающее в среду с меньшим параметром преломления на расстояние меньше 200 нанометров.
В нераспространяющейся волне интенсивность света будет вполне достаточной для возбуждения флуорофоров. Однако вследствие ее исключительно незначительной глубины его объем будет очень малым. В результате возникает низкоуровневый фон.
Модификация
Флуоресцентная микроскопия, основанная на полном внутреннем отражении, может реализовываться с помощью эпи-освещения. Для этого необходимы объективы с повышенной числовой апертурой (как минимум 1.4, однако желательно, чтобы она достигала 1.45-1.6), а также частично освещенное поле аппарата. Последнее достигается с помощью пятна небольшого размера. Для большей равномерности используется тонкое кольцо, посредством которого блокируется часть потока. Для получения критического угла, после которого возникает полное отражение, нужен высокий уровень преломления иммерсионной среды в линзах и покровного стекла микроскопа.
