Определение белка в растворе: биуретовая реакция

Белки являются важнейшими органическими веществами, от которых зависит нормальное функционирование любого живого организма. Их содержание в крови и других биологических жидкостях дает представление о физиологическом состоянии организма. Для определения концентрации белка используются различные методы, одним из которых является биуретовая реакция. Рассмотрим ее подробнее.

Сущность биуретовой реакции на белок

Биуретовая реакция - это качественная реакция на белки, основанная на образовании комплексных фиолетово-розовых соединений белков с ионами меди в щелочной среде. Реакцию открыли в 1909 году химики Пиотровский и Рутовский. Получила название по одному из веществ, дающих ее - биурету (диамиду угольной кислоты).

Уравнение биуретовой реакции белков можно представить следующим образом:

Белок + Cu²⁺ + OH^- → комплекс фиолетово-розового цвета.

Или в развернутом виде:

• Белок-NH₂ + CuSO₄ + 2NaOH → Белок-NH-Cu(OH)₂SO₄Na + Na₂SO₄ + H₂O

Группировка атомов вокруг иона меди и придает окраску комплексу. Интенсивность цвета зависит от количества пептидных групп в молекуле белка.

Подготовка к проведению анализа

Для качественного определения белка методом биуретовой реакции необходимо подготовить следующие растворы и оборудование:

1. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр для измерения оптической плотности при длине волны 540-560 нм.
2. Мерная посуда - мензурки, колбы, пипетки.
3. Дистиллированная вода.
4. 0,2 М раствор NaOH.
5. 1% раствор CuSO₄.
6. Биуретовый реактив (смесь из 4,5 г виннокислого калия-натрия, 1,5 г CuSO₄ и 0,5 г KI в 0,2 М NaOH).
7. Исследуемый раствор белка с неизвестной концентрацией.
8. Раствор белка известной концентрации для построения калибровочного графика.

Биуретовая реакция на белки проводится при комнатной температуре в щелочной среде (pH 10-11) с образованием растворимого фиолетово-розового комплексного соединения белка с ионами меди Cu²⁺.

Перед анализом пробы разводят дистиллированной водой, нейтрализуют и удаляют возможные примеси, мешающие определению. Например, гемолиз может повысить результат из-за присутствия белка гемоглобина. Высокое содержание липидов также является интерферирующим фактором.

Для устранения влияния перечисленных факторов используют фильтрование, разведение, осаждение, экстракцию примесей органическими растворителями (спирт, ацетон, хлороформ).

Проведение биуретовой реакции на белок

Качественная реакция на белок биуретовая проводится следующим образом:

1. В пробирку отбирают 1 мл исследуемого раствора, добавляют 1 мл 10% NaOH и 3-5 капель 1% CuSO₄.
2. Содержимое встряхивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.
3. Наблюдают появление устойчивой фиолетово-розовой окраски, указывающей на наличие белка.

При количественном определении готовят серию разведений пробы с известным содержанием белка и строят калибровочный график зависимости оптической плотности раствора от концентрации белка. По графику находят концентрацию белка в анализируемом растворе.

Ошибки могут возникнуть на этапе отбора и подготовки проб, приготовления растворов и измерения оптической плотности. Например, недостаточная очистка раствора от интерферирующих веществ приводит к завышенным результатам.

Для исключения ошибок необходим строгий контроль всех этапов анализа в соответствии с прописанной методикой и требованиями к чистоте реактивов.

Анализ мочи, цельной крови требует предварительного освобождения от форменных элементов центрифугированием или фильтрованием.

Таким образом, биуретовая реакция является простым и надежным способом обнаружения и определения содержания белка при условии тщательного соблюдения всех условий ее проведения. Рассмотрим далее применение этого метода на практике.

Оценка и интерпретация результатов

При проведении биуретовой реакции количественное определение концентрации белка основано на измерении оптической плотности (экстинкции) образующегося окрашенного комплекса на спектрофотометре. Экстинкция прямо пропорциональна концентрации белка в пробе.

Расчет концентрации проводят по формуле:

С_{белка в пробе} = Е_пробы/Е_{стандарта} × С_{стандарта}

где С - концентрация, Е - экстинкция, индекс "стандарт" относится к раствору белка с известной концентрацией, "пробы" - к исследуемому раствору.

В норме содержание общего белка в сыворотке крови человека составляет 65-85 г/л. Пониженные значения могут указывать на печеночную или почечную недостаточность, повышенные - на воспалительные заболевания, нарушения обменных процессов.

Достоинства и недостатки метода

К достоинствам биуретовой реакции относят:

• Простота и доступность.
• Высокая чувствительность - позволяет определить менее 1 мг белка в 1 мл раствора.
• Возможность автоматизации процесса.

Недостатками являются:

• Неспецифичность - положительный результат дают не только белки, но и другие соединения, содержащие пептидную связь.
• Интерференция некоторых веществ, например гемоглобина, билирубина.
• Зависимость интенсивности окраски от природы белка.

При сравнении с другим методом определения белка - методом Лоури - биуретовая реакция менее чувствительна, однако дает более воспроизводимые результаты, особенно при работе с мутными жидкостями (моча, цельная кровь и др.).

Применение в медицине и науке

Биуретовая реакция на белки широко используется в лабораторной практике для экспресс-оценки содержания общего белка в биологических жидкостях - крови, моче, ликворе, слезной жидкости и др.

Определение белка методом биуретовой реакции необходимо для диагностики и мониторинга течения таких заболеваний как амилоидоз почек, гепатит, нефротический синдром. Повышенный или пониженный относительно нормы уровень белка может указывать на различные патологические состояния.

В научных исследованиях этот метод применяется при изучении белоксинтезирующей функции печени, почек, особенностей метаболизма белков.

Кроме того, биуретовая реакция используется для определения качества пищевых продуктов (мясо, молочные продукты), а также в фармацевтическом анализе лекарственных средств и биологически активных добавок, содержащих белок.

Рекомендации по применению метода

Для проведения точного количественного анализа методом биуретовой реакции рекомендуется:

• Тщательно подбирать условия реакции (температура, pH, концентрация реагентов) для каждого типа исследуемого белка.
• Устранять влияние интерферирующих факторов, например, разделяя белки и другие вещества методом гель-хроматографии.
• Использовать свежеприготовленные реактивы и растворы.
• Строить калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

Соблюдение этих правил позволит получать воспроизводимые и надежные результаты при использовании биуретовой реакции.

Перспективы усовершенствования метода

Дальнейшее развитие метода связано с повышением его специфичности и чувствительности, расширением областей применения, автоматизацией процедуры анализа.

Перспективным является создание тест-систем на основе иммунохимических реакций, использующих специфичные к белку антитела. Это позволит исключить влияние посторонних веществ.

Применение нанотехнологий открывает путь к созданию наносенсоров, способных регистрировать минимальные концентрации белка в растворе.

Автоматизация процесса с использованием химических анализаторов делает биуретовую реакцию высокопроизводительным экспресс-методом скрининга содержания белка в клинико-диагностических и научных целях.